新型空间位阻化学发光技术应用研究

2022-11-08王玉堂逯阵毫陈永奇马明渠海

中国医学工程 2022年10期

王玉堂，逯阵毫，陈永奇，马明，渠海

（郑州安图生物工程股份有限公司，河南郑州 450016）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要原因之一，该病每年造成100 万人死亡。乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外壳蛋白，本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的标志［1-6］。现有的乙肝表面抗原的检测有以下几种方法［7-11］：①吖啶酯直接化学发光检测；②碱性磷酸酶和辣根酶的酶促化学发光；③电化学发光。以上的方法均为非均相化学发光反应，需要进行磁分离操作，会延长检测时间，对检测的通量有限制。本研究报道了一种利用Lumigen 公司SPARCAL 试剂构建的均相化学发光技术，可以不需要进行磁洗的操作，即可进行检测，大大缩短了检测时间和耗材使用，并建立了表面抗原的检测试剂盒并评估该试剂的分析性能和临床相关性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

配对的抗体来自于郑州安图生物工程股份有限公司，配套试剂（激发液、本底消除剂、吖啶物质）选用美国Lumigen 公司的SPARCAL 试剂，配套校准品选用郑州安图生物工程股份有限公司成品校准品（批号：20180415）、配套质控选用郑州安图生物工程股份有限公司成品质控品（批号：20171201），样本由郑州安图生物工程股份有限公司提供。磁微粒乙肝表面抗原检测试剂盒来自雅培。

1.2 仪器与设备

板式化学发光仪选自德国BERTHOLD 公司生产的LB-960 化学发光仪。全自动化学发光仪（雅培i2000）。

1.3 实验方法

1.3.1 吖啶-羊多抗标记取用3.5 mg/mL 的羊多抗，用PH=8.5 的硼酸缓冲液稀释至1 mg/mL，在离心管中加入700 μL 的硼酸缓冲液。250 μL 的硼酸缓冲液（1mg/mL），43 μL 的吖啶N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液（1 mg/m），避光室温反应2 h，用硼酸缓冲液稀释至5 μg/mL，透析备用。

1.3.2 辣根过氧物酶（HRP）-抗体的标记取用200 μL HRP 的磷酸盐（PBS）溶液（1 mg/mL），加入5 mg/mL 的过碘酸钠水溶液氧化30 min，PH=8.5的硼酸缓冲液进行透析过夜，加入到150 μL 的鼠单抗（1 mg/mL）中，反应2 h，用硼酸缓冲液稀释至0.5 μg/mL，2～8℃保存。取用200 μL HRP的PBS 溶液（1 mg/mL），加入过碘酸钠水溶液（5 mg/mL）氧化30 min，PH=8.5 的硼酸缓冲液进行透析过夜，加入到150 μL 鼠单抗（1 mg/mL）中，反应2 h，用硼酸缓冲液稀释至0.5 μg/mL，2～8℃保存。

1.3.3 反应方法建立将25 μL 吖啶标记物、25 μL HRP 标记物、样本加入到微孔板孔中，室温避光反应30 min，加入3 μL SPARCAL 本底消除剂，放入LB-960 进行测试发光值（读取1 s 发光值总和）。

1.3.4 精密度评估方法参考美国国家临床实验室标准化研究所的EP5-A2 文件指南，进行精密度试验。采用A 公司三个浓度的质控品进行检测，每天上午和下午各一批，每批检测两次，共进行20 d，3 个浓度样本分别获得80 个测试结果。使用经离群值检验合格的数据进行批内、批间以及总不精密度的计算。

1.3.5 线性范围评估方法参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）的EP6-A 文件，用高值表面抗原样本（浓度在300 IU/mL）和阴性血清两个样本，按照1∶0、0.95∶0.05、0.9∶0.1、0.8∶0.2、0.7∶0.3、0.6∶0.4、0.5∶0.5、0.4∶0.6、0.3∶0.7、0.2∶0.8、0.1∶0.9、0.05∶0.95、0∶1（单位：mL）配成13 个系列浓度样本，在LB-960 上进行检测，每孔重复检测3次，以样本计算浓度为X轴，以实测均值为Y 轴计算线性回归方程。

1.3.6 临床对比评估方法选取40 份临床样本，与雅培的HBsAg 试剂进行对比，确定临床相关性。

2 结果

2.1 精密度考核结果

实验结果看出乙肝表面抗原低值样本检测均值为0.21 mIU/mL，变异系数（CV）分别为CV批内=4.9%，CV批间=6.7%；乙肝表面抗原中值样本检测均值为0.42 mIU/mL，CV批内=4.5%，CV批间=5.8%；乙肝表面抗原高值样本检测均值为4.2 mIU/mL，CV批内=3.3%，CV批间=4.6%。由表1整体结果来看，均值CV批内=4.23%，CV批内=5.7%，表现出较好的精密性。