SLC39A13基因的泛癌分析

陈畅，杨淑雅，刘宝怡，李冕，鲁艳芹，2

［1.山东第一医科大学（山东省医学科学院）生物医学科学学院（省医药生物技术研究中心），山东 济南 250117；2.山东第一医科大学第一附属医院 内分泌科，山东 济南250014］

SLC39A13基因位于11p11.2 染色体处，编码ZIP13 蛋白，在维持细胞内外锌离子平衡中起重要作用［1］。研究发现ZIP13 在结缔组织发育中有关键作用，SLC39A13的异常突变会引起一种结缔组织病脊柱发育不良埃勒斯-丹洛斯综合征3 型（spondylo-dysplastic ehlers-danlos syndrome type 3）［1-2］。ZIP 家族作为重要的锌转运体在癌症的发生发展中起重要作用。目前已有文献证实ZIP 家族相关基因与癌症有关，例如ZIP4 的高表达与胃癌和胰腺癌的恶化有关［3］；胰腺癌早期发生RREB1/ZIP3 的下调导致锌的减少［4］。但目前仅有1 篇文章指出SLC39A13/ZIP13 的高表达与卵巢癌的转移、预后差有关［1］。尚未有SLC39A13的泛癌研究，因此本文首次对TCGA 和GEO 数据库进行深入挖掘，研究SLC39A13在不同癌症发病机制中的分子机制或临床预后中的作用。

1 材料与方法

1.1 基因表达分析

在TIMER2.0 网站（http：//timer.cistrome.org/）中输入“SLC39A13”，比较SLC39A13在TCGA 数据库中不同肿瘤（或特定肿瘤亚型）和相邻正常组织中的表达差异。对于某些正常组织缺乏的肿瘤，利用GEPIA2（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）的“表达分析-框图”模块分析，来获得这些肿瘤组织与GTEx 数据库中对应的正常组织表达差异的数据，设置“P值＜0.01，log2FC＜1”和“输入缺少正常组织对照的肿瘤”。此外，通过GEPIA2 网站的Stage Plot 模块可以得到SLC39A13在TCGA 数据库中肿瘤不同病理阶段的表达情况，用log2（TPM+1）转换后的数据作出“小提琴图谱”。

1.2 生存预后分析

使用GEPIA2 的“生存分析”模块获得所有TCGA 数据库中涉及SLC39A13基因的肿瘤总生存期（OS）和无病生存期（DFS）的显著差异性图，设置参数“Cutoff-high（50%），Cutoff-low（50%）”来区分高表达组和低表达组。假设检验采用对数秩和检验，通过GEPIA2 的“生存分析”模块绘制生存图。

1.3 基因变异分析

利用cBioPortal 网站（http：//www.cbioportal.org/），在“快速选择”区选择“TGCA 泛癌图谱”研究，查询SLC39A13基因的遗传变异情况。在“癌症类型汇总”模块中观察所有TCGA 肿瘤的突变频率、突变类型和拷贝数的改变值（copy number alteration,CNA）。SLC39A13的突变位点信息可以通过“突变”模块显示在蛋白质结构示意图或3D 结构中。利用“比较”模块来获得TCGA癌症病例在有或没有SLC39A13基因突变时的总生存、无疾病、无进展和无疾病生存差异的数据，同时生成P 值为log-rank 的Kaplan-Meier图。

1.4 免疫浸润分析

使用TIMER2.0 数据库的“免疫基因”模块来探索所有TCGA 肿瘤中SLC39A13表达与免疫浸润之间的关系。选择CD8+T 细胞作为癌相关成纤维细胞的免疫细胞。应用 CIBERSOR-ABS、QUANTISEO、EXCEL、MCPCOUNTER 和EPIC 算法进行免疫浸润评估。根据纯度调整后的Spearman's 等级相关实验获得P值和偏相关系数（COR）。数据被可视化为热图和散点图。

1.5 SLC39A13 编码蛋白ZIP13 的相互作用蛋白富集分析

首先使用STRING 网站（https：//string-db.org/），查询单一蛋白质名称（SLC39A13/ZIP13）和物种（人类），随后设置以下主要参数：所需的最低交互分数（低信度0.150）；线条颜色表示交互证据的类型；最大交互的数量（不超过50）和来源（实验证实）。最后筛选出10 个经实验证实的与ZIP13 结合的蛋白。使用GEPIA2 的“相似基因检测”模块，基于所有TCGA 肿瘤和正常组织的数据集，获得了前100 个SLC39A13相关的靶向基因。应用GEPIA2 的“相关分析”模块进行相似基因与SLC39A13基因的相关性分析。应用log2TPM 方块图，得到P 值和相关系数R。此外，使用TIMER2 的“基因相关”模块作出所用基因的数据热图。使用Venn 网站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）来进行交叉分析从而比较SLC39A13结合基因和相似基因。结合这两组数据进行KEGG 路径分析。将基因列表上传到David 网站（https：//david.ncifcrf.gov/）并选择“OFFICIAL_GENE_SYMBOL” 和“Homo Spaiens”分别作为基因标识符和物种，获得了功能注释图的数据。最后将P＜0.05 的结果带入R 包进行GO 富集分析。

1.6 统计学方法

以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因表达数据分析

应用TIMER2.0 方法分析了TCGA 数据库的多种癌症类型中SLC39A13的表达状态。在乳腺癌（BRCA），结肠癌（COAD），头颈鳞状细胞癌（HNSC），肝癌（LIHC），胃癌（STAD）组织中SLC39A13的表达水平高于相应的正常组织，差异有统计学意义（P＜0.001）；宫颈癌（CESC）组织中SLC39A13的表达水平低于相应的正常组织，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1A。

图1 SLC39A13 在不同肿瘤及肿瘤分期中的基因表达分析

将GTEx 数据集的正常组织作为对照，进一步评估SLC39A13在正常组织和肿瘤组织之间的表达差异，在弥漫性大B 细胞淋巴瘤（DLBC），胸腺癌（THYM）组织中，SLC39A13表达高于相应正常组织。在卵巢癌（OV），睾丸癌（TGCT），甲状腺癌（THCA），子宫肉瘤（UCS）组织中，SLC39A13表达低于相应正常组织，见图1B。使用GEPIA2 的“病理阶段”模块观察SLC39A13的表达与癌症病理阶段的相关性，包括乳腺癌，结肠癌，肝癌和皮肤黑色素瘤（SKCM），在这些肿瘤组织中SLC39A13表达普遍呈现上升趋势，差异有统计学意义（均P＜0.05），见图1C。

2.2 生存数据分析

根据SLC39A13的表达水平，将癌症病例分为高表达组和低表达组，研究了SLC39A13的表达与不同肿瘤患者预后的相关性。高表达的SLC39A13与宫颈癌（P=0.027），结肠癌（P=0.023），多形性胶质母细胞瘤（GBM）（P=0.002），脑低级别胶质瘤（LGG）（P=0.003），间皮瘤（MESO）（P=0.009）总体预后不良有关。SLC39A13低表达与胰腺癌（PAAD）（P=0.015）总体预后不良有关，见图2A。无病生存率分析数据显示SLC39A13的高表达与头颈鳞状细胞癌（P=0.044）、脑低级别胶质瘤（P=0.009）、肝癌（P=0.021）、肺鳞状细胞癌（LUSC）（P=0.011）、间皮瘤（P=0.040）、前列腺癌（PRAD）（P＜0.001）患者预后差有关，见图2B。以上数据表明SLC39A13的表达高低与不同类型肿瘤的预后存在差异。

图2 SLC39A13 基因与肿瘤生存预后的关系

2.3 基因变异分析

以SLC39A13突变为主要变异类型的子宫内膜癌（UCEC）患者SLC39A13基因变异频率最高（＞3%）。皮肤黑色素瘤患者仅发生SLC39A13突变，其变异频率＞2%。SLC39A13扩增是肾上腺皮质癌（ACC）和头颈鳞状细胞癌患者的唯一类型，变异频率分别为1.1%和0.96%，见图3A。进一步显示SLC39A13遗传变异的类型和位点，见图3B，发现SLC39A13错义突变是遗传变异的主要类型。此外，还探讨了SLC39A13的基因突变与不同类型癌症患者临床预后之间在潜在联系，见图3C。与无SLC39A13基因突变的病例相比，SLC39A13突变后与子宫内膜癌患者的OS（P=0.252）、DFS（P=0.267）、疾病特异性生存期（DSS）（P=0.164）无明显相关，与无进展生存期（PFS）（P=0.044）有关，见图3C。

图3 SLC39A13 基因突变的分析

2.4 免疫浸润数据分析

肿瘤浸润性免疫细胞，作为肿瘤微环境的重要成分，与癌症的启动、进展和转移密切相关［5-6］。据报道，肿瘤微环境基质中的癌症相关成纤维细胞参与调节各种肿瘤浸润性免疫细胞的功能［5-6］。在此，使用一些算法来挖掘免疫细胞浸润水平和SLC39A13基因在TCGA 数据库中不同癌症类型中的表达水平之间的潜在关系。发现SLC39A13的表达与免疫浸润呈正相关的肿瘤有结肠癌、食管癌、胰腺癌、直肠癌、胃癌、睾丸癌，SLC39A13的表达水平与肾乳头状细胞癌（KIRP）相关成纤维细胞浸润水平呈负相关，见图4。

图4 SLC39A13 基因的免疫浸润富集分析

2.5 ZIP13 的相互作用蛋白分析

为了进一步研究SLC39A13基因在肿瘤发生中的分子机制，筛选出SLC39A13编码蛋白ZIP13 相互作用蛋白，基于STRING 工具，总共获得了10个ZIP13 结合蛋白的实验数据。图5A 显示了这些蛋白质相互作用的网络。使用GEPIA2 数据库结合TCGA 所有肿瘤的表达数据，获得了与SLC39A13表达相关的前100 个基因。图5B 所示，SLC39A13的表达水平与FAM65A、VEGFB、PLA2G15、GLIS2基因（均P＜0.001）呈正相关。相应的热图数据也显示，SLC39A13与上述的4 个癌症类型的基因呈正相关，见图5C。两组数据的交叉分析显示没有共同基因，见图5D。

结合两组数据进行KEGG 和GO 的富集分析。KEGG 数据显示出SLC39A13可能通过参与“代谢途径”和“溶酶体”通路进一步影响肿瘤的发生。GO 富集分析数据进一步表明，这些基因中的大多与酶活动和离子转运密切相关，见图5E。

图5 SLC39A13 编码蛋白ZIP13 相互作用蛋白及其基因富集分析与肿瘤相关性分析

3 讨论

目前尚无从整体角度对SLC39A13进行泛癌分析的文献。本文首次系统地通过生信分析发现SLC39A13在乳腺癌、结肠癌、卵巢癌等肿瘤组织中高表达。已有文献证实在卵巢癌中SLC39A13/ZIP13 是一种重要的肿瘤干细胞调节因子，在卵巢癌组织中过度表达，通过Src/FAK 信号通路调控转移相关基因，促进卵巢癌的转移［1］。这与本文分析结果一致。SLC39A7基因是乳腺癌细胞生存的关键基因，是乳腺癌诊断和预后的重要分子标志物［7］。生信分析发现SLC39A13在乳腺癌组织中高表达，可能作为潜在的表乳腺癌预后分子标志物。高表达的SLC39A13基因与结肠癌的预后差相关。结肠癌曾是全球第五大癌症死亡原因［8］，而根据最新数据预计2021 年结肠癌将成为全球癌症死亡的主要原因［9］。结肠癌也是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一［10］，大约四分之一的患者在初次诊断时就发现有远处转移，导致预后较差［11］。基质金属蛋白酶（MMP）参与结肠癌的局部和远端侵袭，血浆中MMP 高表达与结肠癌预后差相关［12］。据报道，EMT 相关基因的表达与T 细胞的抗肿瘤免疫相关。EMT 基因的高表达与结肠癌的预后差有关，而浸润性T 细胞丰度（ITA）越高与结肠癌的预后好相关［13］。本文发现SLC39A13基因在结肠癌患者中的异常表达也有可能作为结肠癌诊断和预后分析的分子标志物。宫颈癌组织中SLC39A13的表达低于正常组织，其高表达与患者预后差有关。宫颈癌是世界上第四大常见的恶性肿瘤，每年新增超过52 万例，其中超过85%发生在发展中国家［14］。钙活化氯离子通道2（CLCA2）表达的降低可能是宫颈癌患者的一个潜在预后标志物，但其分子机制还有待进一步研究［15］。前胶原赖氨酸，2-酮戊二酸5-双加氧酶（PLOD）是一种有效的预后标志物，与宫颈癌的免疫浸润有关［16］。SLC39A13基因在宫颈癌患者中表达情况也可以作为一个诊断和治疗的辅助标志物。在胰腺癌组织中SLC39A13的表达量低于正常组织，其低表达与患者预后差有关。根据美国癌症协会2019年公布的数据，胰腺癌引起的死亡率在恶性肿瘤中排名第四［17-18］。虽然在了解胰腺癌的分子发病机制方面取得了重大进展，但胰腺癌患者的预后仍然非常差，过去20 年的5 年生存率仅从5%增加到8%。胰腺癌的新分子预后标志物和潜在治疗靶点仍是未来研究方向［19］。临床和实验证据显示与正常/良性胰腺组织相比，人胰腺癌组织中锌的含量持续降低［4］。胰腺癌患者血清锌浓度降低表明，锌和锌转运相关基因可能作为这种恶性疾病的生物标志物或治疗靶点。锌稳态受到细胞中SLC39A/ZIP、SLC30A/ZnT 和金属硫蛋白（MT）的调控。锌稳态失调可能影响癌细胞的异常特征［20］。锌转运体ZIP4、ZIP11、ZnT 和ZnT6 的表达增加预示着胰腺癌的预后不良［20］。生信分析表明ZIP13 的表达降低预示着胰腺癌的预后不良，这为理解锌稳态与胰腺癌之间的复杂关系提供了新的线索。锌稳态相关基因在胰腺癌中的预后和治疗作用机制值得进一步探索［20］。SLC39A13表达量的不同对不同类型的肿瘤影响是不一样的，在临床中，还需要考虑到其他临床特征，通过更深入的分子实验证据来确定SLC39A13的表达是否与上述肿瘤的发生发展有关。

SLC39A13最主要的变异类型是错义突变。子宫内膜瘤患者中发生该基因的错义突变和扩增。子宫内膜瘤是一种遗传性疾病，通常伴有基因突变或异常表达［21］。分析发现SLC39A13的扩增与患者的预后差相关，因此SLC39A13基因突变也有可能是子宫内膜瘤患者预后差的潜在分子标志物。SLC39A13表达与免疫浸润呈正相关的肿瘤有结肠癌、食管癌、胰腺癌、直肠癌、胃癌和睾丸癌，SLC39A13表达水平与肾乳头状细胞癌相关成纤维细胞浸润水平呈负相关。肿瘤免疫浸润细胞从血液迁移到肿瘤组织，并在免疫调节中起重要作用［22］。越来越多研究表明，肿瘤免疫浸润细胞与免疫检查点抑制和预后密切相关［22］。SLC39A13基因与免疫浸润的关系有望为免疫治疗提供新思路。

综上所述，SLC39A13的泛癌分析表明其表达与临床预后、基因突变、肿瘤细胞的免疫浸润之间存在相关性，这有助于从多因素综合分析SLC39A13在肿瘤发生发展中的作用，为临床诊断治疗及基础研究提供帮助。