天然蚕丝混合再生蚕丝纬编针织网的生物学性能*

唐靓，张文元，李跃中

（杭州医学院1.食品科学与工程学院；2.生物工程学院，浙江 杭州 310013）

前交叉韧带（anterior cruciate ligament,ACL）断裂无法自愈［1］。组织工程技术的发展和应用为ACL 重建提供了新的思路和方法［2］。找到合适的生物材料作为一个潜在的支架是组织工程ACL 的关键因素，它必须是生物相容性和可生物降解的，以允许组织长入，并具有优异的力学性能。支架降解速率应与组织长入支架速率相匹配，即降解时间要求同韧带再生的周期相匹配，以及与之匹配的力学性能，并可模拟组织界面特性，这对于新生韧带的形成至关重要。蚕丝脱胶后获得的蚕丝丝素纤维具有独特而非凡机械强度和韧性，具有轻比重、高强度、良好的黏弹性和热稳定性［3］，缓慢的可生物降解性，最小限度炎症反应，已成为用于组织工程韧带很有吸引力的候选材料。天然蚕丝丝素纤维降解缓慢可为细胞生长提供长久的支持，长期保持优良的机械性能。但也因降解缓慢，不能及时腾出空间导致阻碍组织的再生。许多研究结果表明，由于再生蚕丝丝素有一些化学键被打断，一些一级结构与高级结构发生了改变，以至于再生蚕丝丝素材料（例如纤维、膜或多孔海绵状材料）的降解速率明显快于天然蚕丝丝素纤维［4-6］。因此，本实验采用天然丝素纤维与再生丝素纤维混合纬编针织成网状支架，适当调节支架的降解速度。并通过维生素C 诱导制备骨髓间充质干细胞（bone marrow-mesenchymal stem cells,BMSCs）细胞片，覆盖于天然丝素纤维混合再生丝素纤维的纬编针织网上体外培养，观察细胞在支架上的生长情况，并测试其机械强度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5 mg/mL І 型鼠尾胶原（杭州生友生物技术有限公司），α-MEM（HyClone），胎牛血清（上海翌圣）。2 wt%再生丝素溶液由本实验室自制［7］。桑蚕丝（Bombyx Morisilk）、再生蚕丝蛋白纤维购于杭州丝绸市场。新西兰白兔，3 月龄，雌雄不限，约2 kg，生产许可证号：SCXK（浙）2020-0005，新昌县大市聚镇欣健兔场提供。

1.2 仪器与设备

扫描电镜（SEM,XL30-ESEM,Philips-FEI,荷兰），拉力机（QX-W300,上海企想检测仪器有限公司），冷冻干燥机（LL3000,丹麦HetoPowerDry公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 兔BMSCs 提取 参照文献［8］，从新西兰白兔髂骨抽取骨髓，通过密度梯度离心结合贴壁培养法分离、纯化BMSCs。并传代培养。

1.3.2 BMSCs 细胞片的制备 将处于对数生长期的BMSCs 以1×106cells/mL 接种到6 孔板中，37℃、5%CO2培养，隔天换液，待细胞长到近100%时，更换为细胞片诱导液（α-MEM 完全培养基+50µg/mL 维生素C）。培养7 d 后培养板底部可见乳白色半透明膜片形成，用细胞刮刀将其从培养板底完整剥离。

1.3.3 蚕丝纤维针织网支架制备 参照文献［9］，蚕丝通过0.5%Na2CO3溶液煮沸两次，脱去丝胶，得到蚕丝丝素纤维细丝，即为天然蚕丝纤维。按天然蚕丝纤维、再生蚕丝纤维比例约为1∶1 的质量比（含天然蚕丝纤维100根，再生蚕丝蛋白纤维35 根）均匀混合平行排列，逆时针扭合（2 捻）成1 小束（共含纤维单丝270 根）。再将纤维小束按图1 纬编针织成网状物（30 mm×5 mm）。然后将2 wt%再生丝素与5 mg/mL I 型胶原以1∶1 混匀滴加充填于丝网中，尽量使其浸透，-80℃冰箱过夜，置于冻干机冻干。环氧乙烷消毒备用。扫描电镜（SEM）观察。

图1 纬编针织示意图

1.3.4 支架-BMSCs 细胞片复合物的体外培养 将BMSCs 细胞片覆盖缠绕于1.3.3 项已消毒的蚕丝网/胶原-丝素海绵支架上，以丝线稍作固定。37℃、5% CO2培养，1 d 后去除丝线，共培养2周。取1 个支架-BMSCs 细胞片复合物，按细胞SEM 观察的操作规程处理后，行SEM 观察。

1.3.5 支架-BMSCs 细胞片复合物的机械强度检测 取1.3.4 项已培养2 周的支架-BMSCs 细胞片复合物样本6个，参照文献［9］用拉力机进行机械强度测试。将试样固定于拉力机上，拉力至1 N时测其横截面积及夹具间距长度，再以拉伸速度50 mm/min 进行拉伸试验，记录最大载荷、拉伸强度、弹性模量等力学指标。

2 结果

2.1 BMSCs 培养及传代

骨髓经密度梯度离心结合贴壁培养法后，获得BMSCs。通过原代、传代培养，第三代BMSCs生长旺盛，呈长梭形均匀分布生长，增殖迅速（图2）。

图2 BMSCs 传代培养2 d 后呈长梭形均匀分布生长，增殖迅速（×100）

2.2 天然蚕丝纤维与再生蚕丝纤维混合的针织网的SEM 观察

天然蚕丝纤维较细，再生蚕丝纤维较粗（图3A）。蚕丝纤维针织网有较大的孔隙，伸缩性和柔软性良好，并具有足够的内部空间（图3B）。于蚕丝纤维针织网上滴加的丝素-胶原冻干后成海绵状（图3C），可提供细胞停泊、黏附、增殖、迁移场所，以适于种子细胞的生长。

图3 天然蚕丝纤维与再生蚕丝纤维混合的纬编针织网SEM 观察

2.3 BMSCs 在支架材料上增殖、生长的SEM 观察情况

复合培养2周，BMSCs 细胞附于天然蚕丝纤维与再生蚕丝纤维混合的纬编针织网支架上生长，增殖良好，形态较佳，呈立体状生长，并分泌基质（图4）。

图4 BMSCs 于支架上的SEM 观察（×1000）

2.4 针织网-细胞片复合物的机械强度测定

天然蚕丝纤维与再生蚕丝纤维混合针织网-BMSCs 细胞片复合物培养2 周后，其最大载荷、拉伸强度、弹性模量分别为（118.41±13.23）N、（42.78±4.63）MPa、（191.31±19.92）MPa。

3 讨论

传统的组织工程韧带移植后，关节腔内细胞数量不足是导致预后不良的主要原因之一［10-11］。目前的细胞播种技术存在细胞附着效率低、细胞活性差、细胞利用率低等缺点，细胞凝胶复合材料黏附支架强度有限，不能将大量的细胞整合到密集的移植物中等问题［12-13］。即这种支架的一个局限性是它的低孔隙率抑制了细胞的负载和浸润。这些问题需要进一步的研究来改善细胞与支架的组装［14］。因此，人们希望找到加速移植物-骨整合的策略，这将减少生物固定的时间，提高生物固定的可靠性，允许加速康复，并潜在地减少早期移植物拔出和晚期移植物本体失效的发生率。细胞片技术可以很好地解决细胞流失的问题，且费用较低。利用细胞片新模式，以扩大种子细胞的负载，在一定程度上有效地解决了细胞流失的问题，促进细胞外基质（ECM）沉积和良好的界面整合［15］。在蚕丝针织网空隙中添加再生丝素-胶原进行冻干形成海绵状多孔结构，可提供种子细胞停泊、黏附、增殖、迁移场所，防止细胞从支架上漏掉，增加“韧带化”程度，促进细胞沉积和韧带组织再生。同时为后来细胞生长及新组织形成预留了内部空间。

相对于胶原来说，再生丝素蛋白的降解速度相对较慢。胶原最先降解，再生丝素次之降解，天然丝素纤维最后降解，可形成一定的梯度降解作用。丝素蛋白纤维降解缓慢，可在一定时期提供机械支持。随着胶原、再生丝素、天然丝素纤维的梯度降解，可为细胞生长及新组织形成提供空间，而且丝素可降解为数种氨基酸，对修复组织也有部分营养作用。

种子细胞是韧带组织工程化的关键因素，理想的种子细胞需要良好的增殖能力，并能持续分泌特定的ECM，来维持并修复功能的损失。BMSCs 是组织工程常用的成体干细胞，具有获取容易，增殖能力强及多向分化功能［16-17］，是较为理想的韧带组织工程种子细胞。本实验采用支架覆盖BMSCs 细胞片的模式，以扩大种子细胞的负载。

蚕丝支架虽然目前在动物实验中应用广泛，但真正应用于临床还有很长的路要走。未来蚕丝组织工程韧带的发展方向，一方面可以提高和改善蚕丝性能和蚕丝支架结构［18］，更好地与种子细胞相结合，并可与生长因子或其他材料联合应用，以满足临床中ACL 修复的更高需求［19］。

本实验结果表明，BMSCs 细胞片附于充填胶原-丝素海绵的天然蚕丝混合再生蚕丝针织网上复合培养2周，BMSCs 细胞附于支架上生长良好，呈立体状，增殖旺盛，并分泌基质。针织网-BMSCs 细胞片复合物培养2 周后的最大载荷、抗拉强度、弹性模量分别为（118.41±13.23）N、（42.78±4.63）MPa、（191.31±19.92）MPa，机械强度良好，为后续进一步研究与应用打下基础。