皂白散对家兔创面愈合模型创面愈合效果和皮肤微生态的影响

闫小宁 ，冯泽海 ，拓兴伟 ，李文彬 ，闫隽 ，郭蛟 ，杨志波

（1.陕西省中医医院，陕西 西安 710003；2.陕西医药控股集团天宁制药有限责任公司，陕西 榆林 718000；3.湖南中医药大学附属第二医院，湖南 长沙 410005）

创面是正常皮肤由于外力、化学物质及局部血液供应障碍等因素导致的损伤，伴有皮肤的功能及完整性受损。由于感染、残留坏死组织及异物等原因，创面超过2个月仍然无法愈合，称为难愈性创面。难愈性创面发病机制复杂，治疗周期长、治疗费用高，对患者及社会带来了沉重的经济负担[1]。因此，临床上亟需寻找促进创面愈合的有效方法。

皂白散根据祖国医学理论自主研发的产品，课题组前期针对清热燥湿、杀虫止痒这一治疗理念，将皂白散用于治疗手足癣中，可有助于改善皮肤损伤的面积及临床症状[2-3]，进而推测，皂白散可能在促进创面愈合方面存在重要作用。人体皮肤作为一个独特多变的生态系统，一旦这一平衡生态系统被打破，可能会引起皮肤创面愈合困难的情况出现。因此，本研究拟应用家兔创面愈合模型，观察皂白散对其愈合效果和皮肤微生态的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 大耳白家兔，10只，雄性，体质量2～2.5 kg。遵循国家动物饲养规则饲养10 d。本研究经医院动物伦理委员会批准。

1.1.2 药物 皂白散（30 g/袋，陕西医药控股集团天宁制药有限责任公司）。

皂白散溶液配制：称取30 g皂白散粉末放入煮沸的300 mL去离子水中，搅拌溶解充分，冷却分装；皂白散溶液浓度按照人体用量5倍计算。

1.1.3 试剂 HE染色试剂盒、多聚甲醛购自上海碧云天生物技术有限公司；免疫组化试剂盒、显色试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司；基因组提取试剂盒、定量聚合酶链反应（qPCR）产物纯化试剂盒及反转录试剂盒购于德国QIAGEN公司；放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解液、Bradford蛋白检测试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 构建动物模型 本项目参考此前陕西省中医医院发表的《皂白散治疗足癣效果以及安全性的基础研究》[3]中应用的家兔创面愈合模型。分别剪去家兔双耳直径约1 cm皮肤，造成皮肤表面糜烂。

1.2.2 药物干预方法 将家兔左右耳分为模型组和实验组。模型组（右耳）造模后不做任何处理。实验组（左耳）造模后涂抹60%皂白散浸液，0.1 mL/次，1 次/d，共干预 14 d。

1.3 观察指标

1.3.1 家兔创面愈合情况 肉眼观察创面的愈合情况：渗出物、创缘皮肤收缩程度、结痂情况及皮肤颜色的变化。用HVviewin98.0图像分析软件测定创面面积，计算第4、7、14天创面愈合率。创面愈合率=（初始创面面积-未愈合创面面积）／初始创面面积×100%。

1.3.2 HE染色 造模14 d后，处死实验家兔。取家兔双耳背部创面组织，置于4%甲醛中固定24 h，使用生理盐水冲洗后在磷酸盐缓冲液（PBS）中浸泡12 h。梯度乙醇常规脱水、包埋制成石蜡切片，将切片烤干，使用二甲苯透明后脱蜡。使用苏木精染液染色5 min，盐酸酒精分化后水冲洗30 min。伊红染色3 min后，再次进行脱蜡、透明，之后封片，镜下观察创面组织病理学变化。

1.3.3 免疫组织化学染色 取家兔双耳背部创伤组织制作切片，脱蜡水化，进行热修复抗原。滴入5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液封闭。滴加1∶200的增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体（或CD34单克隆抗体），4℃条件下孵育过夜，PBS洗涤。滴加二抗，37℃条件下孵育30 min，PBS洗涤。使用二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒进行切片显色。苏木精复染2 min脱水，透明，封片，显微镜下观察拍照。

1.3.4 qPCR检测 通过Trizol试剂提取兔耳组织总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，使用OD260/OD280在1.7～2.0之间的样本。反转录获得cDNA，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，在PCR仪中进行扩增。扩增完成后，将产物进行电泳，使用凝胶成像系统（Bio-Rad），以 2-ΔΔCT法计算肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-8、IL-10mRNA相对表达水平。引物信息表见表1。

表1 qPCR引物信息

1.3.5 蛋白质印迹法（Westernblotting，WB）检测 使用RIPA裂解液从样本中提取总蛋白，使用BCA试剂盒定量，在100℃沸水中孵育10 min进行变性处理，SDS-PAGE电泳后将蛋白转至PVDF膜，转膜成功后，使用脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗孵育过夜。取出充分洗膜后，转移至稀释过的二抗室温孵育2 h。ECL电化学发光试剂盒显影，GAPDH作为内参蛋白对照。Image J软件分析条带的灰度值。

1.3.6 宏基因组测序 随机收集4只家兔左右耳皮肤样本，委托上海伟寰公司进行宏基因组测序，检测合格的DNA样品，进行文库构建及检测，检测合格的文库将采用Illumina PE150进行测序，测序得到的下机数据（Raw Data）将用于后期信息分析。

1.3.7 生物信息学分析 采用fastP（v0.20.1）软件对原始数据进行质控，对低质量碱基，接头序列进行剪切。采用KneadData（v0.7.4）软件对质控后数据去宿主（基于Bowtie2）。使用MetaPhlAn3对所有样品的全部有效序列进行注释分类，HUMAnN3（v0.11.2）软件将各个样本的读数比对到数据库UniRef90，根据UniRef90身份标识号（ID）和各个数据库的对应关系，获得各个功能数据库的注释信息和相对丰度表并进行丰度聚类分析、主成分分析PCoA和非度量多维尺度分析（NMDS）降维分析。寻找样本或分组之间的特有和共有物种（种水平），对分组较少（2～4个）的方案采用韦恩图分析。韦恩图直观展示样本分组间物种组成相似性及重叠情况。根据各样本在不同水平下（门、纲、目、科、属、种）Top20的物种分布绘制柱状堆积图及聚类热图，直观显示优势类群在样本中的分布情况。

1.4 统计学分析 采用GraphPad软件进行数据分析，最终数据由3次独立实验结果的均数±标准差（±s）表示。统计显著性采用 LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 皂白散对家兔创面愈合率影响 构建家兔创面愈合模型，在干预第4、7、14天观察创面愈合情况，并比较创面愈合率。实验结果显示，与模型组比较，实验组第4、7、14天创面愈合率均显著升高，见图1。

2.2 HE染色法检测创面新生肉芽组织 涂药后14 d，通过HE染色检测皂白散对家兔创面愈合的效果。实验结果显示，模型组家兔肉芽组织增加不明显。实验组家兔肉芽组织生长良好，毛细血管数量增多，创面明显收缩，见图2。

图2 2组创面新生肉芽组织（HE染色×40）

2.3 免疫组织化学染色法检测创面新生肉芽组织成纤维细胞和毛细血管 实验结果显示，实验组成纤维细胞显著多于模型组（P＜0.01）。实验组毛细血管内皮细胞数量多于模型组（P＜0.05），见图3。

图3 2组创面新生肉芽组织成纤维细胞和毛细血管数量

2.4 皂白散对家兔干预后 TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10的水平变化 qPCR和WB检测TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10 mRNA及蛋白水平的水平。实验结果显示，与模型组相比，实验组家兔 TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10 mRNA 及蛋白水平均下降（P＜0.05），见图 4。

图4 皂白散干预后家兔TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10的水平变化

2.5 家兔双耳皮肤样本的分类操作单元（OTU）丰度及优势菌群 根据OTUs的物种注释结果，见图5A，检测家兔双耳皮肤样本中的菌群组成。层次聚类热图中显示前20种差异菌群，见图5B，与模型组相比，实验组家兔皮肤大肠埃希菌、肺炎克雷柏菌丰度显著减少，而K.rhaeticus丰度显著升高。柱状图中进一步验证了家兔双耳皮肤样本的相对丰度存在差异，见图5C。

图5 家兔双耳皮肤样本的OTU丰度及优势菌群

3 讨论

皂白散中白矾、皂矾、皂角均有解毒杀虫、燥湿止痒的功效[4-5]。地皮骨有凉血解热、抑菌抗炎之功效[6]。黄精可制约白矾、皂矾、皂角之燥性，也有抗炎和抗感染的作用[7]，该方剂在修复手足癣创面中的应用价值已被证实。在创面修复过程中，肉芽组织形成通过保护创面、填补创口及机化、包裹创口异物促进愈合，而存在于皮肤损伤中的炎性反应，则延迟创面愈合。因此，本研究通过构建家兔创面愈合模型，使用不同干预方法，观察创面愈合情况、病理情况、肉芽组织生长情况及炎性因子水平，发现皂白散可减轻病理损伤及炎性反应，并促进肉芽组织生长及创面愈合。即皂白散可通过促进肉芽组织生长，缓解皮损部位炎性反应以有效治愈家兔皮肤损伤。

研究发现，定植在皮肤表面的微生物在环境的影响下产生各类分泌物，可形成稳定的微生态环境，防治有害物质入侵并抑制炎性反应，以保护皮肤的健康[8]。皮肤微生态与皮肤健康和疾病之间密切相关，共生微生物群可通过参与皮肤伤口愈合的多种细胞类型之间的相互作用，以调节免疫反应并促进屏障恢复[9]。在一项糖尿病足溃疡的研究中观察到葡萄球菌、链球菌、棒状杆菌、假单胞菌等菌群丰度发生变化，且皮肤共生微生物表皮葡萄球菌，可以调节γδT细胞并诱导穿孔素-2（Perforin-2）表达，进而破坏皮肤中的金黄色葡萄球菌，促进创面愈合[10]。Wu等[11]通过16S rRNA测序分析35例创面样本中药治疗前后的菌群差异，发现中药治疗通过调节创面微生物群可促进伤口愈合。在受损的皮肤中，角质形成细胞产生肾上腺素，通过激活β2-肾上腺素能受体抑制细胞运动，从而延缓伤口愈合，而皮肤菌群产生的微量胺可消除肾上腺素的作用，加速创面愈合[12]。上述研究均表明，皮肤菌群在创面愈合中发挥巨大作用。

因此，本研究进一步通过随机收集4只家兔双耳皮肤样本进行宏基因组学测序，以验证皮肤菌群在创伤修复中的功能作用及皂白散通过调节失衡的皮肤微生态以促进创伤愈合。测序结果显示，与对照组相比，实验组家兔皮肤大肠埃希菌、肺炎克雷柏菌丰度显著减少，而K.rhaeticus丰度显著升高。大肠埃希菌是一种肠道革兰阴性细菌，属于γ-变形菌纲，已被证明与肠道感染以外的多种疾病有关[13]。研究发现，大肠埃希菌可能通过影响创面肉芽组织中的蛋白含量及胶原合成，从而导致感染性创面愈合延缓[14]。而抑制大肠埃希菌的生长和繁殖可以促进成纤维细胞增加，加速肉芽组织的形成，促进伤口的愈合[15]。肺炎克雷伯菌是革兰阴性杆菌，同属于γ-变形菌纲，常会引起坏死性肺炎、肝脓肿等严重的感染[16]，当皮肤受损时，肺炎克雷伯菌侵入会导致严重的伤口感染，不利于皮肤损伤的愈合[17]。K.rhaeticus是可产生细菌纤维素的菌群[18-20]，而细菌纤维素可进一步促进血管内皮生长因子（VEGF）的表达，促进血管内皮细胞与毛细血管的生长及创面的愈合。盛高铭等[21]建立兔耳皮肤创面愈合模型，使用不同方法干预后对比创面愈合的形态学及组织学变化，细菌纤维素有助于肉芽组织的生成，促进创面的愈合。上述研究提示，皮肤创面损伤可导致皮肤菌群的失衡，皂白散可通过改善皮肤菌群失衡状态促进创面愈合。

综上所述，皂白散通过调节皮肤微生态平衡以发挥药理作用，能够有效促进皮肤创面的愈合。