萝卜硫素通过ANXA3/p38和JNK信号通路诱导人皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡

吴敏，李丽，陈鹏飞，顾文燕

（恩施土家族苗族自治州中心医院，湖北 恩施 445000）

肿瘤细胞防治中遇到的最大难题是增殖——癌细胞的反复迁移和侵袭导致其转移至身体其他部位，进一步扩散增殖[1]。非黑色素瘤皮肤癌发病率的增加，迫切需求开发新的治疗方法、预防措施，以及优化诊断。非黑色素瘤皮肤癌起源于角质形成细胞，根据肿瘤发生的细胞类型可分为基底细胞癌和皮肤鳞状细胞癌（Skin squamous cell carcinoma，sSCC）[2-3]。这提示医学工作者需迫切寻找侵袭性和转移性sSCC的预后指标。

膜联蛋白 A3（Annexin A3，ANXA3）属于 Annexin家族，是一种众所周知的膜结合蛋白和Ca2+调节磷脂蛋白。研究已证实ANXA3参与肿瘤细胞扩散、克隆形成能力、侵袭及迁移[4-5]。ANXA3沉默还可抑制其下游信号应激活化蛋白激酶（JNK）和p38传导，进而抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡[6-7]。因此，降低ANXA3/JNK和p38信号活性，可为寻找治疗肿瘤的药物提供思路。

萝卜硫素（Sulforaphane，SFP）是一种天然活性成分，来源于十字花科植物。SFP已在临床上得到广泛应用，在中枢神经系统的抗氧化及抗肿瘤方面研究较多[8-9]。SFP和顺铂联合治疗可减少表皮鳞状细胞的增殖、侵袭和肿瘤形成；而且已有学者提出其对皮肤癌也有防治作用[11-12]。有关研究也证实SFP可通过调节JNK和p38信号传导进而改善小神经胶质细胞损伤[12]。因此，本文观察了SFP对A431细胞生长抑制作用，并研究了其对ANXA3/JNK和p38信号传导的影响。

1 资料及方法

1.1 一般资料

1.1.1 主要药品试剂 SFP（批号：C10268951）、HYN0168（批号：520-33-2，纯度：＞98%）和 MPT0B392（批号：SB203580）均购自美国Sigma公司；Annexin V-FITC/PI（批号：KGA107）和 CCK8试剂盒（批号：40203ES60）购自英国Abcam公司；Caspase-glot-3/9活性测定试剂盒购自美国Promega公司；BrdU试剂盒购自上海Roche Diagnostics公司；t-PARP（批号：ab1098963）、Cle-PARP（批号：ab0983652）、Cle-PARP（批号：ab02764633）、ANXA3（批号：ab2019874）、pp38（批号：ab0023876）、p38（批号：ab1098473）、p-JNK（批号：ab1120984）、JNK（批号：ab2098376）和β-actin（批号：ab1829095）购自英国Abcam公司。

1.1.2 主要仪器 上海医用细胞培养箱（型号：H8263）；美国 Thermo公司酶标仪（型号：DX540）；美国BIO-RAD成像系统（型号：SQX4-GS1500），美国BD公司流式细胞仪（型号：NovoCyte）。

1.2 方法

1.2.1 药物配制 准确称取SFP、p38激动剂HYN0168和JNK激动剂MPT0B392，DMSO充分溶解后，采用完全培养液稀释成相应浓度处理细胞。

1.2.2 A431细胞培养、药物干预及实验分组 采用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，条件设置为5%CO2、4℃恒温，显微镜观察生长至90%左右时进行后续实验。采用 SFP（10～80 μg/mL）处理细胞，将细胞分为 0、10、20、40、80 μg/mL 的 SFP 组；当HY-N0168（2 μg/mL）和 MPT0B392（0.5 μg/mL）处理细胞时，细胞分为对照组、SFP组、SFP+HY-N0168组和SFP+MPT0B392组，进行后续操作。

1.2.3 CCK8实验 将细胞接种于96孔板，密度为1×104个细胞/孔，培养过夜，将细胞分为对照组和SFP处理组。然后加入10～80 μg/mL的SFP处理细胞 24、48、72、96 h 后，每孔加入 100 μL 含 10 μL 的CCK8试剂的DMEM培养液，继续孵育1.5 h，测定细胞吸光度值。

1.2.4 细胞克隆分析 将A431细胞接种于6孔板，每孔1 000个细胞，培养过夜，然后加入10～80 μg/mL的SFP处理细胞6 d后；然后对克隆细胞进行染色并计数。

1.2.5 BrdU试剂盒分析 将A431细胞接种于96孔板，密度为 1×104个细胞/孔，过夜；10～80 μg/mL的SFP处理细胞48 h后，加入BrdU试剂孵育12 h；再检测BrdU偶联细胞，并测定其吸光度（A）值。

1.2.6 流式细胞实验 将细胞分为对照组和SFP处理组（采用含40 μg/mL的SFP的完全培养液培养）。收集各组细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2次，收集细胞，采用2.0 mg/mL的PI和RNase I染液染色30 min，立即检测细胞周期分布情况。另外，收集细胞，PBS重悬后，分别加入Annexin-V FITC和PI处理细胞，最后检测细胞凋亡。

1.3 观察指标

1.3.1 Western blot法分析蛋白表达 将A431细胞接种于6孔板，密度为2×105个细胞/孔，将细胞分为对照组和SFP处理组（采用含40 μg/mL的SFP），二喹啉甲酸法（BCA）检测了上清液中总蛋白浓度，每孔上样40 μg进行电泳分离，恒压70 V，电泳3 h。然后在275 mA条件下电转70 min，封闭1 h后，目的条带放入对应的一抗溶液（1∶1 000）中，4℃摇床孵育过夜。再把条带放入盛二抗（稀释比1∶3 000）的平皿中反应1.5 h。加入4 mL的增强化学发光法（ECL）显影液显色3 min，凝胶成像系统曝光，并利用NanoDrop 2000软件捕获蛋白条带图像。

1.3.2 Caspase-3/9蛋白活性检测 将细胞接种于6孔板，密度为2×105个细胞/孔，将细胞分为对照组和SFP处理组（采用含40 μg/mL的SFP）。裂解细胞，分别加入Ac-DEVD-AMC和Ac-LEHD-pNA，37℃反应1 h，405 nm处测定其吸光度值，即为Caspase-3/9蛋白活性。

1.3.3 Histone DNA酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞凋亡 将细胞接种于6孔板，密度为2×105个细胞/孔，培养过夜，将细胞分为对照组和SFP处理组（采用含不同浓度的SFP的完全培养液培养）。收集各组细胞，裂解细胞，4℃条件下12 000 r/min离心12 min，离心半径为25 cm，收集上清液。然后按照Histone DNA ELISA检测说明书进行操作。

1.3.4 ANXA3质粒转染 ANXA3 mimics和ANXA3 inhibitor质粒由武汉巴菲尔生物有限公司合成，序列分别为：5’-CTGGACAGTGTGTTTGA-3’，5’-CCUCAGAGUUCACGGACAU-3’。采用 Lipofectamine 2000试剂转染质粒至A431细胞。然后将细胞分为对照组、SFP组、SFP+ANXA3 mimics组和SFP+ANXA3 inhibior组，再进行后续实验。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SFP抑制A431细胞增殖 不同浓度SFP处理24 h后对 A431细胞活力没有影响（P＞0.05），见图1A；与 0 μg/mL 的 SFP 组比较，40、80 μg/mL 的 SFP处理 48 h 的细胞活力显著降低（P＜0.05）；与 0 μg/mL的 SFP 组比较，20、40、80 μg/mL 的 SFP 处理 72 h的细胞活力显著降低（P＜0.05）；与 0 μg/mL 的 SFP组比较，10、20、40、80 μg/mL 的 SFP 处理 96 h 的细胞活力显著降低（P＜0.05）。采用SFP对A431细胞干预6 d后，药物浓度高于20 μg/mL明显抑制细胞克隆（P＜0.05），见图 1B。SFP处理 A431细胞 48 h后，细胞的BrdU ELISA吸光度值随着药物浓度升高而减小（P＜0.05），见图1C。SFP诱导G1期细胞百分比明显增高，而S期和G2期细胞百分比则减少（P＜0.05），见图 1D。

图1 SFP抑制A431细胞增殖

2.2 SFP对A431细胞凋亡的影响 与0 μg/mL的SFP 组比较，10、20、40、80 μg/mL 的 SFP 处理 48 h的抗凋亡蛋白t-PARP表达显著降低，而促凋亡蛋白Cle-PARP和Cle-Caspase3表达水平显著升高（P＜0.05），见图 2A。与 0 μg/mL 的 SFP 组比较，20、40、80 μg/mL的SFP处理48 h的Caspase-3活性显著升高（P＜0.05），见图 2B；与 0 μg/mL 的 SFP 组比较，40、80 μg/mL 的 SFP 处理 48 h的 Caspase-9活性显著升高（P＜0.05），见图2B。另外，SFP还能诱导A431细胞中组蛋白DNA水平，并显著增强凋亡率（P＜0.05），见图 2C、D。

图2 SFP诱导A431细胞凋亡

2.3 SFP对A431细胞中ANXA3/p38和JNK信号传导的影响 相比于对照组，SFP能明显抑制ANXA3水平及 p38和 JNK 磷酸化（P＜0.05），提示SFP对A431细胞中ANXA3/p38和JNK活化有抑制作用，见图3。

图3 SFP对ANXA3/p38和JNK信号通路的影响

2.4 p38和JNK激动剂影响SFP诱导的A431细胞凋亡 发现SFP+橙皮素（HY）-N0168和SFP+MPT0B392组细胞活力相对于单纯SFP组明显升高，而相比于对照组明显降低（P＜0.05），见图4A；另外，SFP+HY-N0168和SFP+MPT0B392组细胞凋亡率相对于单纯SFP组明显降低，而相比于对照组明显升高（P＜0.05），见图 4B。提示 HY-N0168和MPT0B392能部分逆转SFP对A431细胞增殖的抑制作用。

图4 HY-N0168和MPT0B392对A431细胞增殖的影响

2.5 ANXA3沉默和过表达对SFP作用效果的影响 ANXA3 mimics组细胞ANXA3表达水平高于对照组，而ANXA3inhibitor组细胞ANXA3表达水平低于对照组（P＜0.05），见图 5A、B，说明 ANXA3过表达或沉默细胞模型构建成功。SFP+ANXA3 mimics组磷酸化-p38（p-p38）和磷酸化应激活化蛋白激酶（p-JNK）表达水平高于单纯SFP组，诱导细胞生长（P＜0.05）；SFP+ANXA3inhibitor组 p-p38和 p-JNK 表达水平明显降低，细胞活力明显降低，细胞凋亡率显著增高（P＜0.05），见图5C、D。相比于对照组，SFP+ANXA3 mimics组p-p38和p-JNK表达水平明显降低，细胞生长活性降低（P＜0.05），见图 5E；SFP+ANXA3inhibitor组p-p38和p-JNK表达水平明显降低，细胞活力明显降低，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），见图5F。

图5 SFP通过ANXA3调节A431细胞生长

3 讨论

SFP为一种生物活性物质，表现出较为广泛的药理活性，在中枢神经系统疾病和抗肿瘤方面得到很好的验证[8-9]。但是对皮肤疾病治疗方面研究较少，较少报道提出SFP对皮肤性疾病有保护作用[12]。本研究结果也发现，SFP能够抑制A431细胞生长活性；另外SFP还能诱导A431细胞中组蛋白DNA水平升高，因此组蛋白DNA水平可以直观反应细胞凋亡情况。

sSCC对许多常见的化疗药物并不敏感，对于这类疾病没有常规的化疗手段[13]。目前，sSCC的治疗方法是手术，其只能暂时缓解病情、不能抑制肿瘤细胞转移和改善患者生存率[14]。于是，寻找新的治疗该疾病的药物显得至关重要。ANXA3基因在肿瘤细胞中表达明显增高，介导癌细胞的生物学行为[4-5]。另外，p38和JNK信号分子与皮肤癌发生发展密切相关，其主要参与细胞增殖、迁移、分化、凋亡及炎性反应[15-16]。研究发现ANXA3可通过激活肝癌干细胞中JNK信号通路活化，进而促进肿瘤的形成[17]。另外，ANXA3沉默还可抑制其下游信号p38传导，进而诱导肿瘤细胞凋亡[7]。

本文研究发现SFP能明显抑制ANXA3、p-p38和p-JNK水平，进而降低t-PARP表达、诱导Cle-PARP和Cle-Caspase3水平，还降低了Caspase-3/9活性；最终阻滞A431细胞生长，促使其凋亡发生。既往研究提出，SFP可通过抑制JNK信号传导起着抗炎的作用[18]，还可通过抑制p38降低Caspase依赖的细胞凋亡[19]。本实验进一步采用p38激动剂、JNK激动剂与SFP共同干预A431细胞，发现其可以部分逆转SFP对细胞生长的抑制作用，说明SFP可通过p38和JNK信号通路调节A431细胞生长。

ANXA3作为p38和JNK的正向调节因子，其高表达可降低SFP对p38和JNK磷酸化的抑制作用；对ANXA3进行沉默可增强SFP对p-p38和p-JNK表达有抑制作用。说明SFP通过抑制ANXA3表达，进而降低p38和JNK信号传导。ANXA3过表达还可部分逆转SFP对A431细胞增殖的抑制作用，导致其凋亡的降低；ANXA3沉默则促进SFP对细胞增殖的抑制作用，导致其凋亡的增高。总之，SFP可通过抑制ANXA3/p38和JNK信号通路降低A431细胞的增殖活性，为其治疗提供了新思路。