两株PGPR菌株的花生定殖及对根际细菌群落结构的影响

2022-11-05李颖龙长梅蒋标韩丽珍

生物技术通报 2022年9期

李颖龙长梅蒋标韩丽珍

（贵州大学生命科学学院农业生物工程研究院山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室山地生态与农业生物工程协同创新中心，贵阳550025）

植物根际促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指生活在植物根际、对其生长有益的微生物菌群。相比传统化肥施用造成的环境污染和隐患，利用PGPR制备的微生物菌剂具有更强的环境友好性及对土壤肥力的持续性改善作用，已愈加受到大家的关注［1］，因此深入探讨PGPR对植物的促生机制有利于合理拓展其应用范围。目前已有芽胞杆菌属（Bacillus sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.）、固氮菌属（Azotobacter sp.）等多个种属的PGPR菌株被报道，它们通常具有溶磷、固氮、产生植物激素、分泌铁载体等多种促生特性，可以促进多种作物的生长［2］。然而，并非具促生特性的PGPR菌株均可对多种植物发挥有益作用，其在宿主植物根际的有效定殖对于发展稳定的PGPR-宿主植物相互关系是关键的步骤，根际定殖的能力是田间应用PGPR菌株必须考虑的因素［3］。然而也有报道一些分离自根际的菌株可以促进植物生长，但并不能有效地在根际或植物组织中定殖［4］。因而，为了更好地理解PGPR的生态学功能、解析其对植物的根本促生效应，对于该菌株进入土壤后如何与植物互作，包括根际或根部组织的定殖及对本土根际生态影响的研究非常必要。

对于定殖的研究主要采用抗生素标记、荧光标记或扫描电镜观察的方法。抗生素标记法利用逐步提升抗生素浓度的诱变手段，或导入抗生素基因获得对其较高抗性的突变株，通过对数量的监测可以较好地反应菌株的定殖情况［5］；Pathania等［6］发现利福平标记Bacillus sp. MT7菌株在番茄根尖的定殖数量更高。利用绿色荧光蛋白标记则可以在荧光显微镜下直观地观察到菌株的定殖部位，Zhai等［7］的研究表明GFP标记的沼泽红假单胞菌GJ-22菌株能定殖于烟草和水稻的根部和叶面。而利用扫描电镜也已成功观察到假单胞菌属菌株在葡萄根部的定殖［8］。联合扫描电镜、GFP标记及抗生素标记技术进行PGPR菌株定殖规律的研究，可以更清晰地揭示促生菌长期稳定定殖的能力。

土壤微生物群落多样性与其生态系统的结构、功能密切相关，在维持土壤肥力和生态平衡中发挥着重要作用，也是提高土壤生产力和可持续性的基础［9］。当PGPR引入根际土壤时，可能会影响根际土壤微生物多样性以及群落结构，参与植物与土壤的相互作用，从而影响植物的生长和产量［10］，因此通过分析PGPR对土壤微生物群落多样性的影响也可以反映PGPR与植物的互作关系及其在植物促生中发挥的作用［11］。

花生是世界范围内种植的5种主要油料作物之一，我国花生的种植面积位居世界第二［12］。作为重要的经济作物和油料作物，利用环境友好型的微生物菌剂提高花生产量是有效且可行的办法。项目组在前期研究中分离筛选到2株具有多重促生特性的PGPR菌株，即耐酪氨酸束村氏菌（Tsukamurella tyrosinosolvens）P9和吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）P10［13-14］；其单接种或混合菌液的接种均可以明显促进花生幼苗的生长，根际土壤的细菌总数及固氮、溶磷等功能菌群数明显增多，土壤酶活性提高，植株及土壤的营养指标有所提升［15］；但2个菌株进入土壤后如何发挥对花生的促生影响尚未有更深入的解析。本研究拟通过GFP标记、利福平标记法联合扫描电镜以探讨2个PGPR菌株在花生幼苗不同组织中的定殖规律，通过分析菌株接种对花生根际土壤细菌多样性的影响，从菌株本身的定殖及影响微生物群落结构的角度、综合解析P9和P10菌株施加到土壤后对花生发挥的促生机理，并为下一步研制微生物菌剂奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

耐酪氨酸束村氏菌（Tsukamurella tyrosinosolvens）P9和吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）P10为本项目组前期分离筛选的PGPR菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号分别为CCTCCAA 2020052和CCTCCM 2019172。携带GFP基因及氨苄青霉素抗性基因的质粒pHT315-GFP由贵州省农科院刘作易教授惠赠。

1.2 方法

1.2.1 GFP标记菌株的获得及花生根部定殖部位的观察将过夜活化的P9、P10菌液转接至LB液体培养基中培养，以感受态细胞制备试剂盒（宝生物，大连）制备P9和P10感受态细胞；以质粒提取试剂盒（天根，北京）提取pHT315-GFP质粒；在感受态细胞中加入适量质粒混匀后、以热激法进行转化，并涂布于含Amp的LB平板上培养过夜。挑取单菌落于DMIL荧光显微镜下（LEICA，德国）观察标记菌株的发光情况；根据GFP基因序列设计引物对（GFP-F：5'-TTGCTTCGGCTCGTATGTT-3'，GFP-D ：5'-GTGTTCAATGCTTTGCGAGAT-3'），利用菌落PCR及测序进一步验证，其中PCR扩增条件为：94℃ 4 min ；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，34 cycles；72℃ 3 min。

花生种子经20%过氧化氢20 min消毒、无菌水冲洗后，放置于装有湿润滤纸的无菌平皿中，28℃条件下3 d萌发后，幼苗移栽到含200 mL 1/2 MS培养液的组培瓶中28℃培育，待长至2-3 cm高度后，加入50 mL GFP标记菌株的活化菌液，以等量无菌水作对照。3 d后取花生的根部徒手切成1 cm左右的小段、以0.05%龙胆紫染色2 min、蒸馏水清洗制片后于荧光显微镜下观察。

1.2.2 2株PGPR菌株的利福平抗性标记及遗传稳定性分析将过夜活化的P9、P10菌液转接至含10 μg/mL利福平的LB液体培养基中、30℃、150 r/min摇床振荡培养，逐步提高培养液中利福平的浓度对菌株进行驯化，获得可在含300 μg/mL利福平的LB培养基中生长良好的抗性菌株P9r、P10r。将抗性菌株在LB斜面上连续传代20次后，挑取单菌落于含300 μg/mL利福平的LB平板上培养并观察菌落形态、爬片法制片后经Regulus 8100扫描电镜（HITACHI，日本）观察细胞形态。将2株原始菌株及驯化获得的利福平抗性菌株活化后，分别转接至LB液体培养基及含300 μg/mL利福平的LB液体培养基中、定时测定菌体浓度并绘制生长曲线；P10菌株通过测定OD600值表征菌体生长量，而P9菌株由于在液体培养基中培养时呈小菌丝球状悬浮于其中、采用平板稀释涂布法进行活菌计数以表征菌体浓度。

1.2.3 利福平抗性菌株的促生特性分析以钼蓝比色法测定培养液的可溶磷含量［16］、以Salkowski法测定IAA含量［17］、以CAS法测定铁载体相对含量、以2，4-二硝基苯肼法测定粗酶液中α-酮丁酸含量进行ACC脱氨酶活性的测定［18］，对利福平抗性的P9r和P10r进行溶磷、产IAA、产铁载体及分泌ACC脱氨酶活性等促生特性的测定。

1.2.4 利福平抗性菌株在土壤及花生不同组织定殖动态的追踪花生种子消毒萌发后、移栽到含300 g灭菌土壤的育苗盆中常规培育，一周后浇菌处理。盆栽实验设CK、P9r接种组、P10r接种组、混合菌株（P9r+P10r）接种组，每个处理3个重复，每盆用灌根法接种75 mL菌液（浓度为108CFU/mL），混合接种组为P9r和P10r的等量混合菌液，CK组浇等量无菌水。分别于灌根后的第0、1、3、5、7、9、11、15、20、25、30天时采集土壤及植株的根、茎进行菌落数测定；其中根、茎样本经1%次氯酸钠消毒30 s、75%酒精30 s、无菌水洗涤后进行后续测定。另外，接种3 d时，切取根茎材料经扫描电镜观察菌株定殖；浇菌30 d后对花生的生长指标及叶绿素含量进行测定。

1.2.5 非灭菌土壤条件下2株PGPR对花生根际土壤细菌多样性的影响盆栽实验设CK组、P9接种组、P10接种组、混合菌株（P9+P10）接种组，每组6个重复，取活化菌液灌根接种于种植花生幼苗的未灭菌土壤中，常规条件下培育30 d后、以抖根法采集根际土壤进行细菌多样性分析（北京诺禾致源生物信息科技有限公司）。经PowerSoil® DNA Isolate Kit（Mobio，USA）提取根际土壤DNA、PCR扩增细菌16S rRNA全长基因，利用PacBio平台进行双端测序。Raw data经校正、SSR过滤、去除嵌合体获得Clean Reads。以97%的一致性进行OTUs聚类，利用Mothur方法与SSUrRNA数据库等进行物种注释分析，使用MUSCLE软件进行快速多序列比对。结合R语言相关软件绘制物种多样性以及群落结构组分图和热图。

1.2.6 数据统计与分析采用IBM SPSS Statistics 20.0软件对数据进行单因素方差分析，并采用Duncan新复极差法进行差异显著性分析，独立样本t检验和Pearson相关性分析；并采用Excel统计数据并制图。

2 结果

2.1 2株PGPR菌株的GFP标记及GFP标记菌株在花生根部的定殖

为了明确2个PGPR菌株是否可以在花生根部定殖，首先进行了GFP标记菌株的构建。将pHT-315-GFP质粒转化到P9和P10菌株后，可看到2个菌株在荧光显微镜下均发出稳定的绿色荧光。利用GFP-F/D引物对进行转化子的菌落PCR扩增、电泳后可见转化的P9和P10菌株均扩增出约600 bp大小的片段、与预计目标产物（603 bp）大小相符（图1），测序结果证实为GFP标记菌株。

图1 GFP转化菌株阳性转化子的PCR产物验证Fig.1 PCR verification of positive transformants of GFP-labeled strains

取菌液作用3 d的花生根部进行观察，与CK组相比，可见P9、P10接菌处理花生的根尖及分生区中均有带绿色荧光标记的大量菌株定殖（图2）。

图2 两株GFP标记的PGPR菌株在花生根尖的分布Fig.2 Distribution of two GFP-labeled PGPR strains on the root tips of peanut

2.2 利福平抗性菌株的获得及生长促生特性分析

为了进一步分析2株PGPR菌株在进入花生组织后的定殖动态，对其进行了利福平标记。在获得抗300 μg/mL利福平的P9r和P10r菌株后，将抗性菌株在无压力条件下传代20代，2个菌株仍可在相同浓度利福平的LB培养基上生长良好，其中P9r菌株呈淡黄色、中央凸起、表面粗糙干燥的放射状较大菌落，P10r为无色略透明、湿润、中央突起、边缘整齐的圆形菌落；扫描电镜观察到P9r为长杆状、菌体略弯曲，P10r呈短杆状（图3）；抗性菌株的菌落和镜下形态均与原始菌株P9、P10一致。在含300 μg/mL利福平的LB培养基中，P9r的生长曲线与原始菌株在LB培养基中的生长一致；而P10r在利福平抗性培养基中的最高生长量虽略低于LB培养基中的P10菌株，但其生长趋势基本相同（图4）；表明2株利福平抗性菌株具有良好的遗传稳定性。

图3 两株利福平标记PGPR菌株的菌落形态及细胞形态Fig.3 Colony morphology and cell morphology of two rifampicin-labeled PGPR strains

图4 两株PGPR菌株和利福平标记菌株的生长曲线Fig. 4 Growth curves of two PGPR strains and their rifampicin-labeled strains

驯化获得的利福平抗性菌株P9r和P10r均表现出优良的溶磷性、产IAA、分泌铁载体及ACC脱氨酶的能力，且与原始菌株的促生特性基本一致（表1），进一步表明驯化获得的利福平抗性菌株具有遗传稳定的生理特性。

表1 两株PGPR菌株和利福平标记菌株的促生特性Table 1 Growth-promoting characteristics of two PGPR strains and their rifampicin-labeled strains

2.3 两株利福平标记PGPR菌株在花生根围土壤及不同组织的定殖

在灌根处理1 d后，P9r、P10r及混合接种组的土壤、花生的根及茎中均监测到菌的定殖；且随着时间推移，接菌处理组呈现出相似的定殖动态变化，土壤中的活菌呈缓慢下降，至30 d仍可达104CFU/g数量级；幼苗的根及茎中的活菌呈逐渐上升至峰值并缓慢下降的趋势，至30 d时，P9r的活菌数为（1.08×104）CFU/g，P10r为（5.33×104）CFU/g。其中，浇菌20 d后，P9r在根、茎中的定殖达到最高值，分别为（1.4×105）CFU/g与（1.1×105）CFU/g；P10r在根的定殖峰值为浇菌15 d（2.5×105CFU/g）、而茎的定殖峰值出现在浇菌20 d（1.37×105CFU/g）；混合菌株的定殖动态变化与P10r相似（图5），且在同一时间点的活菌计数时，均表现出P10r数量高于P9r，表明混合接种状况下P10r的竞争定殖能力更强。浇菌处理3 d后取幼苗组织进行扫描电镜观察，与未接种组的幼苗相比，接种P9r、P10r及混合菌液的花生根、茎表面均有与其纯培养物相似形态的菌附着；而且，在混合菌液接种花生的根、茎视野中，也可看到短杆状P10形态的菌体多于长杆状P9形态的菌体（图6）。

图5 两株利福平标记PGPR菌株在花生土壤及根、茎中的定殖动态Fig.5 Colonization dynamics of two rifampicin-labeled PGPR strains in peanut soils，roots and stems

图6 扫描电镜观察两株利福平标记菌株在花生根、茎表面的定殖Fig.6 Colonizaiton of two rifampicin-labeled strains on root and stem surface observed by scanning electron microscope

2.4 两株PGPR菌株对花生生长的影响

接菌处理30 d后测定花生幼苗的生长指标，结果表明（表2），与CK相比，无论是利福平抗性的P9、P10及混合接种处理，亦或是原始菌株的接菌处理，均可以显著提高幼苗的鲜重、株高及根长（P＜0.05）、叶绿素含量也有不同程度提高；而且没有标记的原始菌株对花生的促生作用更为明显；此外，混合菌株处理组较单一菌株的接种处理对植株有更好的促生影响，呈现出混合菌株一定的协同增效作用。

表2 两株利福平标记菌株及PGPR菌株对花生生长的影响Table 2 Effects of two rifampicin-labeled and their original PGPR strains on the growth of peanuts

2.5 两株PGPR菌株对非灭菌土花生根际细菌多样性的影响

2.5.1 花生根际土壤Alpha多样性和Beta多样性分析对花生根际土壤样本进行16S rRNA全长测序分析细菌群落的多样性，通过Barcode识别后共获得71 056条Raw data，过滤后共获得高质量的细菌有效序列68 690条（96.67%），平均每个样本5 724条，样本平均序列长度为1 452 bp。对样本进行Alpha多样性和Beta多样性分析，Shannon稀释曲线显示曲线趋于平缓，样本测序量已饱和，足以反映样本中的绝大多数物种信息；PCA分析结果表明，3个接种处理组的细菌群落相似性更高，且与对照组存在一定程度的差异（图7）。

图7 花生根际土壤多样本的香农曲线和PCA分析Fig.7 Multi-samples Shannon curves and principal component analysis（PCA）of bacterial communities in peanut rhizosphere soil

2.5.2 花生根际土壤细菌群落结构分析选取相对丰度排名前10的物种，从门水平上分析花生根际土壤组成，前10的物种分别为变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidia）、酸杆菌门（Acidobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、放线菌门（Actinobacteria）、Unidentified bacteria、厚壁菌门（Firmicutes）、硝化螺菌门（Nitrospirae）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、Candidatus_Pacebacteria，其中变形菌门及拟杆菌门为花生根际土壤的优势菌群（占细菌群落的72.95%-75.74%）。相对于CK，3个接种组的变形菌门、硝化螺菌门丰度略有降低，拟杆菌门及厚壁菌门的丰度略微增高（图8）。

在纲水平上，接菌处理组的γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）和硝化螺菌纲（Nitrospira）的丰度较CK有所减少，且δ-变形菌纲的丰度显著降低（P＜0.05），而拟杆菌纲（Bacteroidia）、芽孢杆菌纲（Bacilli）的丰度呈不同程度增加。目水平上的进一步分析显示，接菌处理组的黄单胞菌目（Xanthomonadales）丰度有明显降低，噬几丁质菌目（Chitinophagales）、芽孢杆菌目（Bacillales）、链霉菌目（Streptomycetales）和浮霉菌目（Planctomycetales）的丰度有不同程度增加。科的水平上分析，黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）的相对丰度值分别比CK组降低了20.80%、5.61%、18.52%；噬几丁质菌科（Chitinophagaceae）的相对丰度值分别增加了12.10%、6.77%、11.56%，是丰度值变化较大的类群。此外，拜叶林克氏菌科（Beijerinckiaceae）、罗丹诺杆菌科（Rhodanobacteraceae）、链霉菌科（Streptomycetaceae）的丰度均大于CK组，而鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）、黄杆菌科（Flavobacteriaceae）的丰度低于后者。

在相对丰度排名前30的属中，溶杆菌属（Lysobacter）在P9、P10、P9+P10接菌处理组中的相对丰度显著降低（P＜0.05），无色杆菌属（Achromobacter）、假黄单胞菌属（Pseudoxanthomonas）、Sphingoaurantiacus、unidentified_Acidobacteria的丰度较CK略有降低；而 Flavihumibacter、unidentified_Rhizobiaceae的相对丰度值显著增加（P＜0.05）；Ramlibacter、微枝形杆菌属（Microvirga）、Stenotrophobacter、芽孢杆菌属（Bacillus）、Dyella、链霉菌属（Streptomyces）、小梨形菌属（Pirellula）等的丰度较CK有不同程度增加（图8）。此外，仅在P9处理组中检测到有束村氏菌科（Tsukamurellaceae）、束村氏菌属（Tsukamurella）的存在，其相对丰度值为0.0542%，而种水平上也有相应的Tsukamurella_tyrosinosolvens存在，与P9菌株为同一个种。

图8 不同处理组花生根际土壤细菌群落在门水平和属水平上的相对丰度Fig. 8 Relative abundances of bacteria communities at phy-lum and genus level in rhizosphere soils of different treated peanuts

3 讨论

PGPR可以通过直接与间接作用对植物产生有益影响，而这些作用方式的关键是PGPR在植株的定殖［19］。PGPR菌株的定殖能力是发挥促生作用重要的影响因素，为竞争根系分泌物中的营养物质，PGPR应高效定殖于植物，才能更好地发挥作用［20］。

当PGPR施加到土壤中后，是否具有较强的竞争性并能存活是第一个问题。Coy等［21］报道利福平标记的芽孢杆菌属菌株可以定殖在狗牙根根围土壤中，但在4周后活菌数下降明显。Mirzaei等［22］认为菌株的有效定殖不仅是指其可以在植物根际生存，而且还应该可以在新生根中生长和繁殖。有报道进入土壤中的解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）UCMB5113菌株被观察到黏附于拟南芥根部［23］；荧光假单胞菌（P. fluorescens）Ps006和B. amyloliquefaciens Bs006可以定殖和进入香蕉根表面，且根部有Bs006细菌细胞团的形成［24］。细菌细胞必须要首先进入植物组织增殖，方能发挥对植株的有益影响。伯克霍尔德氏菌属PsJN菌株首先定植于葡萄根表面、进入内生根并蔓延至葡萄花序茎及花梗，然后通过木质部维管束蔓延至未成熟的浆果［25］；Paenibacillus jamilae QHZ11 可以进入马铃薯芽的分生组织、维管束及根尖分区［26］。

本文对2株PGPR菌株在土壤、花生根茎中的定殖进行研究，发现GFP标记的P9和P10菌株均可以定殖在花生幼苗的根尖部、聚集在根毛处并进入根分生区的细胞间隙；而利福平标记菌株的定殖动态显示2个菌株还可在茎中稳定地定殖，也证实2个PGPR菌株具有由根迁移至茎组织中的能力。由于束村氏菌属是一类稀有放线菌，对其生态学功能的研究报道极少；仅有Marín等［27］研究发现束村氏菌属C-924能定殖在玉米根际土壤。这是首次发现束村氏菌属、耐酪氨酸束村氏菌可以定殖于植物内部并发挥促生作用。另外，研究显示P9和P10两菌株的定殖能力存在一定差异；对混合菌株接种土壤及植株中抗性菌落的分析表明同一时间点的P9r菌落数均低于P10r，单菌株接种的结果也显示出P10r在15 d达到最高值后的定殖菌落数下降较缓慢，但P9r在20 d定殖至最高后下降相对较快，也说明P9在花生中的定殖能力略弱于P10。而且，对利福平标记菌株生长曲线及溶磷、产IAA、分泌铁载体及ACC脱氨酶活性的测定结果表明，利福平抗性的驯化过程对2株PGPR菌株的生长生理特性并无明显影响。

除了可以通过定殖于根际及植物而发挥直接促生外，PGPR对植物还有间接的促生效应，其可以通过改变其微生态环境、进而为植物提供良好的生存环境［28］。本研究中，从门的水平上，P9、P10及混合菌株接种组的拟杆菌门丰度略上升而变形菌门的丰度略有下降，这与Paenibacillus mucilaginosus和Sinorhizobium meliloti共接种的苜蓿土壤有相似的变化［29］。在科的水平上，接菌组土壤的噬几丁质菌科和拜叶林克氏菌科的相对丰度增加；噬几丁质菌科的多个种属具固氮能力且可抑制植物病原菌生长［30］，而具有自生固氮能力的拜叶林克氏菌科对于调控植物生长可发挥一定作用［31］。已有报道黄单胞菌属的菌株大多为植物病原菌、会附着在宿主组织上感染植物使其致病［32］；而黄单胞菌科的相对丰度在3个接菌处理组的土壤中均低于CK。总体上表现出有益菌群的丰度增加而与病原相关菌群丰度降低的特点。在属的水平上，Flavihumibacter和unidentified_Rhizobiaceae的丰度显著增高，已发现Flavihumibacter的菌株大多从自然环境中分离［33］；unidentified_Rhizobiaceae通常是与豆类根瘤相关的共生体，为宿主提供必需的营养物质、植物生长调节剂和其他重要的植物代谢物［34］。

本研究中，3个接菌处理组的芽孢杆菌属和链霉菌属的相对丰度均高于未接菌组。芽孢杆菌属隶属于厚壁菌门、芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目，链霉菌属隶属于链霉菌目、链霉菌科，在这几个分类等级上其相对丰度值均相应地高于CK组。厚壁菌门与土壤中的碳循环紧密相关，芽孢杆菌属菌株具有更高的营养转化率及对植物的促生作用［35］，被认为是最重要的生物肥料［36］；厚壁菌门和芽孢杆菌在接种Rhodopseudomonas palustris的甜叶菊土壤中丰度明显上升［37］。链霉菌不仅可以产生丰富多样的抗生素，近年来也被发现该属的菌株具有溶磷、产生铁载体和IAA等促生特性，具有较强的定殖能力［38］；在枯草芽孢杆菌NCD-2接种盐胁迫番茄的土壤中表现出链霉菌丰度升高的变化［39］。因而，PGPR显然也可以通过改变土壤中微生物群落结构，减少有害菌群或增加有益菌群，从而改变植物根际土壤微生物环境促进植物生长。

此外，P9菌株接种的土壤中检测到束村氏菌科（0.0542%）、束村氏菌属（0.0542%）、耐酪氨酸束村氏菌（Tsukamurella tyrosinosolvens）（0.0542%）；由于束村氏菌是一类稀有放线菌、很少从植物生长的土壤环境中分离到［40］，这也间接证实该菌株可以定殖于土壤；而混合菌株接种组的土壤中未检测到该种群，推测可能是由于P10菌株的定殖优势更高的缘故，这与混合菌株接种的土壤及根茎样本中P9菌株的活菌数始终低于P10相一致。