烟曲霉A-16产纤维素酶工艺优化及酶学特性

张开平 刘燕丽 涂绵亮 李继伟 吴文标

（1. 百色学院，百色 533000；2. 西南大学食品科学学院，重庆 400716）

尽管经济在快速发展和社会在不断进步，但是全球仍然面临着能源危机、粮食短缺和环境恶化等严峻挑战，采用适当的生物催化剂将绿色、可持续、可再生且尚未利用的生物质转化为高附加值产品已成为当前国内外关注的焦点［1］。纤维素是由β-1,4葡萄糖苷键连接而成的线性多聚糖［2］，是自然界中分布最广［3］、含量最多、最清洁的可再生资源［4］，具有很高的利用价值［5］。复杂的结构特征［6］使纤维素分子的生物降解效率低［7］；目前其大多用于燃烧或直接废弃，这造成了极大的资源浪费和环境污染。如果能通过纤维素酶将纤维素进行高效降解得到可进一步开发利用的产品，则对缓解全球面临的能源与粮食危机、环境污染等问题具有重要的意义。

相对于具有成本昂贵、设备要求严格、产物提取困难和二次污染严重等缺陷［8］的化学降解法而言，纤维素酶降解法具有反应条件温和、操作简单、糖化率高、成本低、副产物少且无污染等优点［9-10］。虽然纤维素酶来源广泛（例如细菌、放线菌和丝状真菌均可分泌纤维素酶［11-13］），但是目前国内外研究最多的是丝状真菌，如木霉属、根霉属、曲霉属等［14-15］。然而在生产技术上仍然面临纤维素酶活力低、热稳定性差、最适pH范围较窄的难题，这严重限制了其在工业化生产中的应用［16-18］。

本研究采用刚果红染色法从土壤中筛选出一株性能优良、高产纤维素酶的真菌烟曲霉，对该菌发酵稻草秸秆生产纤维素酶的工艺参数进行了优化，并对所产纤维素酶的特性进行了研究，旨在为纤维素类农业废弃物的开发利用提供有效的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 从百色市大王岭自然保护区常年堆积的腐败木质下的土壤中采集土样，保存在4℃冰箱备用。

1.1.2 培养基 参照文献［19-20］，作综合调整。

（1）富集培养基（g/L）：CMC-Na 20.00、KH2PO41.00、Na2CO30.50、MgSO4·7H2O 0.20、FeSO40.05、MnSO40.05、蛋白胨 10.00、牛肉膏 10.00，pH自然。

（2） 筛 选 培 养 基（g/L）：CMC-Na 20.00、MgSO4·7H2O 0.20、KH2PO41.00、（NH4）2SO42.00、FeSO40.05、MnSO40.05、琼脂 15.00，pH自然。

（3）种子培养基（g/L）：CMC-Na 20.00、MnSO40.05、蛋白胨 10.00、MgSO4·7H2O 0.20、KH2PO41.00、（NH4）2SO40.50，pH自然。

（4）复筛液体培养基（g/L）：CMC-Na 20.00、MgSO4·7H2O 0.20、KH2PO41.00、（NH4）2SO42.00、FeSO40.05、MnSO40.05，pH自然。

（5）摇瓶发酵培养基（g/L）：稻草粉5.00、蔗糖5.00、蛋白胨10.00、酵母膏3.00、吐温-80 2.00 mL、KH2PO41.00、MgSO4·7H2O 0.20、MnSO40.05、（NH4）2SO40.50、CaCl20.40、FeSO40.05，pH 自然。

（6）斜面保藏培养基：PDA培养基。

1.1.3 主要试剂与仪器 刚果红、3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠等均为国产分析纯，稻草粉（经清洗、干燥、粉碎、过120目筛，待用）；ThermoTaq DNA Polymerase（#EP0402） 和 dNTP Mix（R0192）购至Thermo公司，SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（SK8131）和Ezup 柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（B518259）购至上海生工。

DNA电泳槽（H6-1），上海精益有机玻璃制品仪器厂；稳压电泳仪（DYY-8），上海琪特分析仪器有限公司；电子分析天平（BSll0S），上海一恒科学仪器有限公司；显微镜（YS 100），日本Nikon；紫外可见分光光度计（UV-2700），日本岛津；电热恒温水浴锅（DK-8D），上海森信实验仪器有限公司；凝胶成像仪（SC850），上海山富科学仪器有限公司；PCR仪（2720 thermal cycler），美国 Applied Biosystems公司；可控恒温摇床（HZQ-F160），上海跃进医疗器械厂；生化培养箱（SPX-300B），上海博泰实验设备有限公司；高速离心机（YXJ-2），湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；测序仪（3730XL），美国Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 纤维素酶产生菌的筛选 富集培养：取5.0 g土样置于45 mL生理盐水中，加入无菌玻璃珠充分振荡混匀，用滤纸过滤除去固体杂质得样品液。取每种样品液1.0 mL加入盛有30 mL富集培养基的250 mL锥形瓶中，置于45℃、150 r/min的恒温摇床中培养5 d，得到第一代菌群。取1.0 mL一代菌液转入30 mL新鲜富集培养基中，在45℃、150 r/min条件下培养5 d，得到第二代菌群；相同条件下重复富集培养8轮，得到热稳定性纤维素酶产生菌群。

初筛培养：梯度稀释富集后的培养液10-5-10-7倍，分别取0.1 mL涂布于平板筛选培养基，45℃培养4-5 d后，用刚果红染色法［20］判断纤维素酶产量，挑取透明圈较大且生长迅速的菌落划线分离，直到获得纯培养，编号，保存备用。

复筛培养：将初筛获得的单菌落转接到种子培养基中，在45℃、150 r/min条件下培养3 d，制得一级种子液，然后按1%的接种量接入复筛培养基中，于45℃、150 r/min下摇床培养5 d。

1.2.2 纤维素酶活的测定 粗酶液的制备：发酵结束后，发酵液于12 000 r/min、4℃条件下离心15 min，收集上清液得粗酶液。葡萄糖含量的测定：采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定。羧甲基纤维素酶（carboxymethyl cellulase，CMCase）及滤纸酶（filter paper activities，FPA）活性的测定分别参照文献［3，21］。酶活力单位的定义：在45℃条件下，每分钟催化底物水解释放1 μmol葡萄糖所需要的酶量，即为1个酶活力单位（U），以U/mL表示。

1.2.3 菌种鉴定 （1）菌株形态观察：将目标菌株点种至筛选培养基平板上，于45℃条件培养3 d后，观察其菌落形态，结合《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》等进行分类鉴定。

（2）分子鉴定：从菌株的形态学特征，初步判断该菌株为真菌。①DNA提取：用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取A-16菌株基因组DNA，置-20℃冰箱保存。②PCR扩增：以提取的DNA为模板，选用真菌18S rDNA通用引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和 ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，PCR扩增体系和反应条件参照ThermoTaq DNA Polymerase（#EP0402）试剂说明书进行，扩增结束后将PCR产物于4℃冰箱保存。③PCR产物的检测：用1.5%琼脂糖凝胶电泳对扩增的PCR产物进行检测。④PCR产物纯化：用上海生工的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（SK8131）进行纯化回收。⑤测序：纯化的目的片段与pMD18-T载体连接，然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选并获得阳性克隆子［21］。扩增产物交由上海生工生物股份有限公司，用BigDyeTr v3.1 Cycle Seq Kit（4336921）对纯化后的PCR产物进行测序。⑥构建系统发育进化树：将测得的18S rDNA序列提交GenBank数据库中进行BLAST比对，选取相似性高的微生物序列，用Clustal W 2.0软件进行多重序列比对，用MEGA 7.0软件中的N-J邻接法构建系统进化树。

1.2.4 烟曲霉发酵稻草粉生产纤维素酶条件优化 以CMCase和FPA酶活力为指标，依次研究不同产酶条件［稻草粉添加量（2、4、6、8、10、12 g/100 mL）、产酶培养基初始pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、发酵温度（25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃）和发酵时间（2、3、4、5、6、7、8 d）］对纤维素酶活力的影响。在单因素试验基础上，以稻草粉添加量、初始pH、发酵温度和发酵时间为变量，以CMCase酶活力为响应值，设计了4因素3水平共29个试验点的响应面优化试验。

1.2.5 数据分析 每个试验点重复3次，实验数据用PASW Statistics 18软件进行单因素方差分析，多重比较用LSD法，结果以平均值±标准偏差表示。响应面试验数据用Design - Expert 10.0 Trial软件通过Box-Benhnken组合法进一步优化产酶工艺参数。

1.2.6 纤维素酶酶学特性初步测定 酶反应最适温度及热稳定性：分别在30℃-90℃条件下测定CMCase和FPA酶活力，确定最适反应温度；其中以酶活力最高时所对应的温度为参照，设定该温度下的酶活力为相对酶活100%。然后将酶液分别置于不同温度（30℃-90℃）的恒温水浴锅中保温90 min，保温结束后快速冷却，在最适反应温度条件下测定CMCase和FPA酶的残余酶活；以未经处理的酶液作对照。

酶反应的最适pH和pH稳定性：以不同pH的缓冲液［柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0-6.0）、磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液（pH 7.0-8.0）、甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 9.0-11.0）］配制1% CMC-Na溶液或滤纸条溶液作为反应底物，在最适反应温度下测定CMCase和FPA的酶活力，确定CMCase和FPA酶的最佳作用pH，其中以酶活最高时所加的缓冲液pH为标准，设定该pH条件下酶活力为100%。然后将酶液与不同pH（3.0-11.0）缓冲液等体积混合，4℃冰箱保存24 h，于45℃保温2 h，再将酶液调回到最适pH值；在最适反应温度下测定CMCase和FPA酶的残余酶活力，用未经处理的酶液作对照。

2 结果

2.1 产纤维素酶菌株的筛选

对从土壤中初筛得到20余菌株进行纯培养，复选出D/d值最大的8菌株，其CMCase和FPA酶活力见表1。由表1可知，菌株A-16产的CMCase和FPA酶活力分别为2 516.24 U/mL和686.48 U/mL，总活力均高于其它菌株，基本可以确定A-16菌株产的纤维素酶能力是最强的。因此，后续试验选择A-16菌株作为出发菌株，开展其发酵稻草粉生产纤维素酶工艺条件研究及对所产纤维素酶的酶学特性进行测定。

表1 产纤维素酶菌株酶活性Table 1 Enzymatic activity of the cellulase-producing strains

2.2 菌株鉴定

将菌株A-16接种到筛选培养基上培养3 d，菌落呈绿色，菌丝体产生大量分生孢子梗，顶端膨大为近似球形的顶囊，表面长满单层或双层的小梗；随着培养时间延长，菌落变为墨绿色（图1）；根据菌落形态及显微镜观察，再结合《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》的比对，初步判断该菌株是曲霉属真菌。为了进一步确定该菌的类别，采用通用引物ITS1、ITS4对菌株A-16基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，PCR产物只得到一条在500-600 bp之间有明亮的条带，将PCR回收纯化后产物送到上海生工进行测序，结果得到扩增的A-16菌株ITS序列片段大小为569 bp。将测得的18S rDNA序列提交GenBank数据库中进行BLAST比对（登录号：MH846230），挑选其中5株模式菌株的ITS序列进行同源性分析，用MEGA7.0软件构建系统进化树，结果见图2。A-16菌株的18S rDNA序列与GenBank数据库中烟曲霉（Aspergillus fumigatus）MT529449在同一个分支上，亲缘关系最近，相似性达99%以上，再结合形态特征可以初步鉴定该菌为烟曲霉，命名为Aspergillus fumigatus A-16。

图1 菌株A-16菌落形态Fig.1 Colony morphology of the strain A-16

图2 菌株A-16基于18S rDNA的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of the strain A-16 based on 18S rDNA

2.3 烟曲霉发酵稻草粉生产纤维素酶单因素试验

2.3.1 稻草粉添加量对纤维素酶活性的影响 由图3可知，随着稻草粉添加量的增加，CMCase和FPA酶活力先上升后下降，不同稻草粉添加量对纤维素酶活性的影响显著（P＜0.05）。当稻草粉添加量为8 g/100 mL时，纤维素酶活性最强。继续增加稻草粉浓度，反而降低了介质的孔隙率，溶氧不足，菌体生长受限，使得纤维素酶的活性降低。由多重比较得出，稻草粉添加量为8 g/100 mL时产酶能力（以所产纤维素酶的活性计）与其它稻草粉添加量时的相比差异显著（P＜0.05）。因此，稻草粉添加量为8 g/100 mL时最佳。

图3 稻草粉添加量对A. fumigatus A-16菌株纤维素酶活力的影响Fig.3 Effects of straw powder on the cellulase activity of strain A. fumigatus A-16

2.3.2 pH对产纤维素酶活性的影响 由图4可知，产酶培养基初始pH对A-16菌株产纤维素酶活性影响显著（P＜0.05）。随着pH升高，CMCase和FPA酶活力变化趋势基本一致，均呈现先增大后减小。由LSD法多重比较可知，初始pH 6.0时，CMCase和FPA酶活力最高，且明显高于其它初始pH时菌株所产的纤维素酶活力（P＜0.05），说明A. fumigatus A-16菌株在中性偏酸性条件下能分泌较高的纤维素酶量，在碱性条件下不利于产酶。因此，选择最佳培养基初始pH为6.0。

图4 初始pH对A. fumigatus A-16菌株纤维素酶活力的影响Fig.4 Effects of initial pH on the cellulase activity of strain A. fumigatus A-16

2.3.3 温度对产纤维素酶活性的影响 在其它条件恒定的情况下，不同发酵温度对产酶的影响见图5，菌株A-16生长温度较宽且具有较强的高温耐受性，随着温度升高，CMCase和FPA的酶活力呈现先上升后下降的趋势。当温度过高时，加快菌体老化，不利于纤维素酶的代谢积累，并且酶的稳定性显著下降。当温度为65℃时，CMCase活力达到最大值，为2 714.6 U/mL，显著高于其它培养温度下的菌株产纤维素酶活力（P＜0.05），是25℃培养条件下酶活力的1.95倍。然而，当温度为55℃时，FPA的酶活力达到最高，为902.8 U/mL，由LSD法多重比较可知，55℃培养条件下产的FPA活力较其它培养温度的显著增大（P＜0.05）。因此，A.s fumigatus A-16产纤维素酶的适宜培养温度范围为55℃-65℃。

图5 温度对A. fumigatus A-16菌株纤维素酶活力的影响Fig.5 Effects of temperature on the cellulase activity of strain A. fumigatus A-16

2.3.4 发酵时间对纤维素酶活性的影响 由图6可知，不同发酵时间对CMCase和FPA的酶活力有显著影响（P＜0.05）。发酵5 d时，CMCase和FPA的酶活力均达到最高，继续延长培养时间，营养供应不足，菌体开始老化，纤维素酶活缓慢下降。由LSD法多重比较可知，发酵到第5天时FPA酶活力虽然和第6-8天酶活力差异不显著（P＞0.05），但综合考虑时间成本、低耗能等因素，选择最佳产酶时间为5 d。

图6 发酵时间对A. fumigatus A-16菌株纤维素酶活力的影响Fig.6 Effects of fermentation time on the cellulase activity of strain A. fumigatus A-16

2.4 响应面法优化实验

响应面设计及试验结果见表2，方差分析见表3，根据回归方程作出不同因子的响应曲面图见图7。对表2实验数据进行二次回归拟合后，得到回归方程为：Y=2 916.68-215.88A-40.00B+29.83C-17.42D-9.15AB+50.10AC-56.46AD+154.38BC-59.47BD-35.82CD-301.240A2-301.57B2-334.09C2-254.14D2

图7 响应曲面图Fig.7 Response surface diagram

表2 响应面设计及试验结果Table 2 Response surface design and test results

由表3可知，模型极显著（P＜0.0001），模型失拟项不显著（P＞0.05），说明模型选择合适，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析和预测。模型的可决系数R2为0.905 8＞0.9，说明90.58%的CMCase活力的变化可以用该模型来解释。离散系数（CV）为5.30%，其值较低，表明整个试验具有较好的精确性和可靠性，从而也说明该模型拟合度较好。

表3 响应面模型及回归方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of the response surface model and the regression equations

同时，模型中自变量一次项A和二次项A2、B2、C2、D2对 CMCase活力的影响极显著（P＜0.01），BC对CMCase活力的影响显著（P＜0.05），其它因素交互作用均不显著（P＞0.05）。根据F值大小可知，各因素对CMCase活力的影响大小为：稻草粉添加量＞pH＞发酵温度＞发酵时间。对回归方程进行优化，得到最佳发酵条件为：稻草粉添加量7.28 g/100 mL，pH 5.94，发酵温度65.03℃，发酵时间5.01 d。在此条件下预测最大CMCase活力为2 956.52 U/mL。为了方便实际操作，将最佳发酵工艺参数修正为：稻草粉添加量7 g/100 mL，pH 6.0，发酵温度65℃，发酵时间5 d。为了验证预测值与实际情况是否吻合，进行3次重复试验。结果表明CMCase活力平均值为2 954.76±2.33 U/mL，与模型预测值接近，说明该模型具有较高的可信度。

2.5 菌株A-16产纤维素酶的特性

2.5.1 酶反应最适温度及热稳定性 粗酶液在不同温度条件下测定CMCase和FPA酶活力，结果（图8-A）表明，CMCase和FPA酶的适宜反应温度均为70℃，且在40℃-80℃范围内均有较强的酶活性，仍然保持在80%以上，说明所得纤维素酶属于高温酶。将酶液在不同温度条件下分别保温90 min，然后在70℃下测定CMCase和FPA酶的残余酶活力，结果（图8-B）表明，CMCase和FPA酶活力在80℃之内稳定性较好，处理90 min酶活力还保持在80%以上，继续升高温度至90℃保温90 min，CMCase和FPA酶的相对酶活力均保持在70%以上。相比较CMCase，FPA的热稳定性更好一些，90℃温度范围内随温度升高酶活力下降比较缓慢，90℃处理90 min后，仍然保持76.3%的酶活力，说明菌株A-16所产的纤维素酶具有良好的热稳定性，具有良好的开发价值。

图8 菌株A-16产纤维素酶作用的最适温度及其热稳定性Fig.8 Optimal temperature of cellulase activity of strain A-16 and and its thermo-stabilities

2.5.2 酶反应的最适pH和pH稳定性 粗酶液于不同pH条件下测定CMCase和FPA酶活力，结果（图9-A）表明，CMCase和FPA酶的最适反应pH均为6.0，且在pH 5.0-8.0范围内催化分解羧甲基纤维素和滤纸的效率高，可见菌株A-16所产纤维素酶的最佳反应条件为中性偏酸性。pH稳定性实验结果（图9-B）表明，CMCase和FPA酶活力在pH 5.0-7.0范围内比较稳定，放置1 d后可保持70%以上的酶活力，尤其在pH 6.0时，CMCase活力可保持84.6%，FPA酶活力可保持86.9%；若反应体系pH低于5.0或高于7.0时，CMCase和FPA酶活力快速丧失，说明该酶是一种中性偏酸性酶，对pH变化比较敏感。

图9 菌株A-16产纤维素酶作用的最适pH及其pH稳定性Fig. 9 Optimal pH of cellulase activity of strain A-16 and its pH stabilities

3 讨论

理想的产纤维素酶效率是微生物发酵法具有实际应用价值的关键因素之一［13，22］。单因素和响应面优化建立的培养纯化A. fumigatus A-16的条件组合具备高效生产纤维素酶的能力。本研究所得的优化条件使A. fumigatus A-16发酵产品的总纤维素酶活力较优化前提高了26.4%，优化效果十分明显。以所获产品的纤维素酶活力为考察指标进行比较，A.fumigatus A-16菌株及其培养条件优于已报道的A.fumigatus B-2-3菌株及其培养条件［23］。在优化条件下，与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis DX4）［24］和放 线 菌（Streptomyces azureus T23-B）［25］相 比，A.fumigatus A-16能得到更高总纤维素酶活力的发酵产品，菌株产酶活力高了34.35%以上。

与其它报道的产纤维素酶菌株相比，本研究分离纯化出来的烟曲霉A-16所产纤维素酶的活力更高、耐热和耐酸特性更优异，具有潜在的开发价值。在工业生产中，耐高温纤维素酶有助于提高纤维素降解率。目前，已有文献报道了耐高温纤维素酶生产菌，巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）［26］，嗜热烟曲霉（A. fumigatus JCM 10253）［20］芽孢杆菌（Bacillus sp. BSC6-1）［18］，但这些耐高温菌产纤维素酶的最适反应温度为45℃-60℃，热稳定性在50℃-70℃，而本研究筛选得到的A. fumigatus A-16菌株所产CMCase和FPA酶的适宜反应温度条件为70℃，在80℃热处理90 min，酶活力还保持在80%以上，其中FPA酶在90℃保温90 min仍然保持76.3%的酶活力。较其它已报道的菌株具有明显优势，是一株性能优良的耐高温纤维素酶生产菌株。本研究筛选得到的烟曲霉A-16与蒋芳等［27］、金伟等［28］筛选出来的耐高温真菌在最适反应温度（均为70℃）上相似，但其它条件均不相同。同时，A. fumigatus A-16菌株所产CMCase和FPA酶在pH 5.0-7.0范围内稳定性较高，放置1 d后可保持70%以上的酶活力。这一温和的pH范围有利于生产应用。

本研究建立的培养纯化A. fumigatus A-16的优化条件组合中，使用稻草粉为基础培养基。我国有大量这种原料，价格低廉，生产成本低。同时，实现废弃物资源化利用目标，减少资源浪费和环境污染。烟曲霉A-16是一株原始野生型菌，后续研究工作将通过诱变、菌种改良或蛋白质工程技术等现代生物技术手段来构建高效纤维素酶基因工程菌，优化生产工艺提高纤维素酶产量和增强酶活稳定性，旨在为耐高温酸性纤维素酶的规模化生产及工业化应用提供优良菌株。

4 结论

本研究从土壤中筛选到一株性能稳定、高产纤维素酶的A. fumigatus A-16。通过响应面分析法优化获得最佳产酶条件：稻草粉添加量7 g/100 mL，pH 6.0，发酵温度65℃，发酵时间5 d，在最优发酵条件下，CMCase活力达到2 954.76 U/mL，FPA酶活为1 086.37 U/mL，较优化前提高了26.4%。该菌产纤维素酶的最适反应条件为70℃，pH 6.0，具有较强的耐热能力和较好的pH稳定性，可作为耐高温酸性纤维素酶生产的资源菌，具有纤维素酶制剂规模化生产和纤维素资源开发应用的潜力。