猕猴桃AcWRKY70基因序列克隆及其对溃疡病病原菌和激素处理表达模式分析

曲 东，燕 飞，3，刘欣瑞，康 雪，曾海涛，3，张 羽，3，4

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000；2.陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723001；3.陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心，陕西 汉中 723001；4.秦巴生物资源与生态环境省部共建国家重点实验室，陕西 汉中 723000)

猕猴桃为猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(ActinidiaLind L.)木质藤本果树，原产于我国，因其果实维生素C含量高并富含丰富的营养物质而深受人们喜爱[1]。然而，随着猕猴桃栽培面积迅速扩大，猕猴桃溃疡病、根腐病等病害已经严重影响了猕猴桃产业的发展，尤其是丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)引起的猕猴桃溃疡病的发生，对猕猴桃树生长发育的危害往往是毁灭性的，严重时会使得植株死亡造成毁园，给果农带来难以负担的经济损失[2]。目前，猕猴桃溃疡病抗病分子机理研究报道较少，因此，挖掘猕猴桃抗溃疡病关键基因、探究其响应病原菌胁迫应答机制正逐渐成为当前猕猴桃育种研究的热点问题。

转录因子(Transcription factors，TFs)是植物信号传导途径的重要组成部分，它决定了植物对生物和非生物胁迫刺激的反应能力，及其对植物发育过程中植物内部信号的响应[3]。WRKY转录因子是植物中特有的一类转录调节因子，也是转录因子中最大的家族[4]。在生物及非生物胁迫响应中，WRKY转录因子在多个信号转导途径的调控中起关键作用[5]。近年来，多种植物WRKY超家族成员已被报道，包括大豆(197个)、拟南芥(75个)、大麦(45个)、西瓜(63个)等[6-8]。WRKY转录因子DNA结合域(DNA-binding domain，DBD)以N-端的保守的WRKYGQK氨基酸序列和C-端的锌指结构域为特征[4]，依据N-端DBD的数量和C-端锌指结构序列特征可将WRKY转录因子分为四类组：Ⅰ组(2个WRKY DBD)、Ⅱ组(一个DBD和不同的C2-H2锌指结构)、Ⅲ组(1个DBD和C2-HC锌指结构)和Ⅳ(不完整WRKY结构域，不含锌指结构)[9]。研究表明，WRKY转录因子能够与(T)TGAC(C/T)结合(如W-box)，从而诱导相关基因表达维持细胞内稳态；其以多种同源和异二聚体组合作为激活剂或阻遏剂参与各种细胞质和核过程[4，10]。

许多物种的WRKY家族都被证实可直接或间接参与植物的生长、发育、生物和生理过程，而且在植物非生物胁迫反应与植物天然免疫过程中起重要作用[4，11-12]。研究表明，TaWRKY33基因在小麦耐盐胁迫响应中发挥重要作用[13]。将拟南芥的WRKYIIa亚家族成员在水稻中过表达，能够提高水稻抵抗白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv．ryzae)的抗病性[14]；分析沉默BnWRKY70基因的油菜植株，在接种黑胫病菌(Leptosphaeriabiglobosa)之后，发现基因沉默油菜叶片更易感病，表明油菜BnWRKY70基因沉默使得油菜易感黑胫病[15]；在抗白粉病(ErysiphegraminisD.c.f.sp.triticiE.Marchal)小麦(Brock)品种中发现TaWRKY26基因在小麦对白粉菌侵染的应答反应过程中发挥了积极作用[16]。另外研究发现，WRKY转录因子的表达能够被植物激素调控，如脱落酸(Abscisic acid，ABA)诱导OsWRKY51和OsWRKY71基因抑制水稻种子糊粉层细胞中的赤霉素(GA)信号[17]。同样，AtWRKY18、AtWRKY40、AtWRKY60转录因子参与由植物激素水杨酸(Salicylic acid ，SA)和茉莉酸(Jasmonic acid，JA)介导的信号通路[18]。当沉默辣椒CaWRKY40基因后，辣椒抗青枯假单胞杆菌(Ralstoniasolanacearum)抗性下降，而外源SA、JA能够上调该基因的表达[19]。棉花GhWRKY22基因沉默植株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌的敏感性增加，该基因是通过SA和JA激素的途径参与病原菌响应过程的[20]。

研究人员在提高植物抗病能力方面进行了大量的研究，但目前在猕猴桃抗溃疡病胁迫响应方面的相关报道较少。为挖掘猕猴桃关键抗病基因，探究AcWRKY70基因在猕猴桃抗病响应中的作用，本研究以抗病品种徐香和高感病品种红阳猕猴桃为材料[21]，克隆AcWRKY70基因序列，并进行蛋白性质及结构分析、系统进化等生物信息学分析；采用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法探究该基因在不同抗性猕猴桃品种根、茎、叶、花组织中的表达模式及不同抗性猕猴桃品种在病原菌(Psa)、水杨酸与Psa(SA+Psa)共同处理和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)与Psa(MeJA+Psa)共同处理下的表达差异，初步探究AcWRKY70转录因子在不同抗性品种猕猴桃响应溃疡病胁迫作用机制，以期为AcWRKY70转录因子在猕猴桃抗溃疡病相关研究和应用提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 植物材料与处理

试验材料源自陕西省汉中市城固县自然好猕猴桃专业合作社猕猴桃园，移栽于陕西省资源生物重点实验室的嫁接2年生高感病品种红阳猕猴桃(Actinidiachinensisvar.chinensisHongyang)和抗病品种徐香(Actinidiadeliciosavar.Xuxiang)猕猴桃幼苗。

分别取红阳猕猴桃和徐香猕猴桃的茎、花、叶，装入无菌的样品管内标记，放入液氮速冻，并保存于-80 ℃冰箱备用。

将红阳猕猴桃和徐香猕猴桃幼苗分为4组，喷洒水为第1组(正常生长组)，先用水对叶片进行喷洒，7 d后用丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种菌液(陕西省资源生物实验室分离鉴定保存菌种，GenBank序列登录号：MW404385，菌液浓度1.0×108cfu/mL)进行喷洒处理为第2组(Psa)；先用水杨酸(2.5 mmol/L)对叶片进行喷洒预处理，7 d后用丁香假单胞猕猴桃致病变种液喷洒叶片为第3组(SA+Psa)；先用茉莉酸甲酯(1 mmol/L)对叶片进行喷洒预处理，7 d后用丁香假单胞猕猴桃致病变种液喷洒叶片为第4组(MeJA+Psa)，预处理方法参照文献[22]；处理后分别在0，6，12，24，48，72 h 这5个时间点取样，装入无菌的样品管内，用记号笔标记采取样品的处理和时间，立即放入液氮，转入-80 ℃冰箱保存待用，每个样品重复3 次。

1.2 猕猴桃AcWRKY70基因的克隆及测序

采用TransZol Plant试剂(TransGen Biotech)提取不同处理时期样品RNA，经电泳检测(1%琼脂糖凝胶)合格，Thermo NanoDrop 2000分光光度计测定各样品的浓度以及OD260/280、OD260/230值；后反转录为cDNA(TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix，TransGen Biotech)并保存于-20 ℃冰箱备用。

根据本实验室前期WRKY转录因子预测分析，以猕猴桃数据库(http：//kiwifruitgenome.org/)中WRKY蛋白基因的序列(Ach24g147941-TA)为模板，利用Primer 6.0软件设计引物，AcWRKY70基因上下游引物分别为5′-ATGGGCATCCTTCGGC-3′和5′-TCACTCACCCTCACCAA-3′。以猕猴桃叶片cDNA为模板，利用高保真酶进行PCR，退火温度为54 ℃，PCR产物检测(1%琼脂糖凝胶)、胶回收(E.Z.N.A.®Gel Extraction Kit)、载体连接等方法参照本实验室方法[23]，选取阳性克隆送北京擎科生物有限公司(西安测序部)进行测序。

1.3 AcWRKY70序列的生物信息学分析

利用ORF finder(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在线分析开放阅读框，通过 NCBI Conserved Domain Search Service在线分析AcWRKY70蛋白序列的保守结构域(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)；利用DNAMAN 9.0 软件对猕猴桃AcWRKY70蛋白质与其他物种WRKY蛋白质进行比对分析；使用 ClutsalX v1.83 程序进行多序列比对，然后将比对结果输入到Mega 7.0 软件中，利用邻接法 (Neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，Bootstrap 值取 1 000 次；利用 ExPASy-ProtParam tool 在线软件(http：//web.expasy.org/protparam/)进行蛋白质理化性质分析；利用 Expasy 中的 ProtScale 在线软件(http：//web.expasy.org/protscale/)分析AcWRKY70蛋白质的亲水性和疏水性；利用NetPhos v3.1(http：// www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在线工具对猕猴桃 AcNPR1蛋白进行潜在的磷酸化位点预测分析；利用SOPMA数据库(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)得到AcWRKY70可能的二级结构；利用 SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org)进行同源建模，构建AcWRKY70的三级结构域模型；通过CELLO2GO 在线分析工具(http：//cello.life.nctu.edu.tw/cello2go/)预测亚细胞的可能定位。

1.4 AcWRKY70基因实时荧光定量分析

荧光定量反应程序及反应体系按照荧光定量试剂盒(Perfectstart Green qPCR Supermix，全式金生物，北京)说明完成，采用美国ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪系统进行实时荧光定量分析。荧光定量上下游引物分别为5′-GCTACGGAATCTATTGGAGA-3′和5′-AATCACACGCACACTTCA-3′；内参基因上下游引物分别为5′-CTGTGAAACTGCGAATGGCTC-3′和5′-TTCCAGAAGTCGGGGTTTGT-3′，试验采用3次生物学重复，不同材料中目的基因的相对表达量采用2-ΔΔCt方法计算。利用 SPSS 21.0统计分析软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 AcWRKY70基因克隆以及序列分析

据本实验室前期对猕猴桃WRKY转录因子家族生物信息学分析，预测得到一个与AtWRKY70最密切相关的猕猴桃WRKY基因，将该序列(Ach24g147941-TA)命名为AcWRKY70，为AcWRKY70基因序列设计特异性引物，并以红阳叶片RNA反转录产物为模板进行AcWRKY70基因序列PCR扩增(图1-A)，测序得AcWRKY70基因序列全长为906 bp(GenBank登录号：MW881147)。另外，以徐香叶片cDNA为模板获得的WRKY基因序列与红阳AcWRKY70基因序列只有个别碱基有差异。对红阳AcWRKY70基因序列进行生物信息学分析， NCBI ORF Finder 在线工具进行开放阅读框预测结果显示，AcWRKY70基因含有开放阅读框长度为885 bp，编码294个氨基酸；NCBI Conserved domains在线工具分析表明，该蛋白结构中第122—182位区域间含有1个WRKY保守结构域，包含61个氨基酸(图1-B)。

2.2 AcWRKY70基因编码的氨基酸序列比对分析

将克隆得到的猕猴桃AcWRKY70基因的氨基酸序列在NCBI数据库中进行序列比对，利用DNAMAN 9.0对不同物种WRKY转录因子的氨基酸序列多重比较，结果表明，猕猴桃AcWRKY70氨基酸序列与中华猕猴桃(Actinidiachinensis)、茶树(Camelliasinensis)、蓝果树(Nyssasinensis)、橡胶树(Heveabrasiliensis)、杨梅(Morellarubra)、银白杨(Populusalba)、葡萄(Vitisvinifera)的WRKY类转录因子保守结构域一致性较高，N端有一个WRKYGQK保守结构域，C端为CX7CX24HXC(C2-HC)型锌指结构，属于Ⅲ类 WRKY 转录因子(图2)；其与中华猕猴桃、茶树、蓝果树蛋白序列相似性分别为99.32%，50.62%，48.73%。

M.GL DNA Marker 2000 Ladder；1.红阳AcWRKY70基因PCR 扩增产物。M.GL DNA Marker 2000 Ladder；1.PCR product of Hongyang AcWRKY70 gene.

红色框线.WRKYGQK保守结构域；红色箭头.C2-HC锌指结构域。Red box.The conserved domain of WRKYGQK;Red arrows.The zinc finger domain of C2-HC.

2.3 猕猴桃AcWRKY70的系统进化分析

采用 Mega 7.0 软件对12个物种的WRKY蛋白序列与红阳猕猴桃AcWRKY70蛋白序列进行系统进化分析并构建进化树(图3)，结果显示，WRKY蛋白被大致分为2组，红阳猕猴桃AcWRKY70蛋白与杨梅、银白杨、葡萄、茶树等聚为一组，红阳猕猴桃AcWRKY70蛋白与茶树和蓝果树WRKY蛋白亲缘关系最近。

红阳猕猴桃AcWRKY70蛋白序列位于红框中。The AcWRKY70 protein sequence of kiwifruit is located in the red frame.

2.4 AcWRKY70基因编码蛋白的理化性质及磷酸化位点分析

利用在线工具ProtParam 分析AcWRKY70基因编码的蛋白质的分子式为 C1436H2271N405O455S23，编码 295个氨基酸，分子质量为 33.226 ku，理论等电点(pI)5.94，脂肪指数为 58.01，不稳定指数Ⅱ为58.52，属于不稳定蛋白；通过对氨基酸疏水性进行分析，总平均亲水性系数为-0.545，为亲水性蛋白。利用 NetPhos 对该蛋白的磷酸化位点进行分析，发现AcWRKY70蛋白均具有丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Try)磷酸化位点(图4)。

图4 AcWRKY70 蛋白磷酸化位点预测Fig.4 The phosphorylation sites prediction of AcWRKY70 protein

2.5 AcWRKY70蛋白二、三级结构分析及亚细胞定位分析

利用SOPMA在线预测软件对AcWRKY70基因编码蛋白的二级结构进行分析，发现AcWRKY70蛋白的二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链、β-转角四部分构成，占比分别为64.75%，23.05%，9.49%，2.71%；无规则卷曲是AcWRKY70蛋白的主要二级结构。通过SWISS-MODEL软件对AcWRKY70蛋白的三级空间结构模型进行预测，结果表明，该蛋白至少由3个α-螺旋、2个较稳定的反向平行β-折叠和许多无规则卷曲构成 (图5)。利用CELLO2GO在线工具进行亚细胞定位预测，结果显示，AcWRKY70蛋白亚细胞定位在细胞核得分为2.85，远远高于细胞中其他部位，AcWRKY70蛋白最可能定位于细胞核当中参与猕猴桃其他基因表达的调控过程。

图5 AcWRKY70蛋白三级结构预测Fig.5 The tertiary structure prediction of AcWRKY70 protein

2.6 猕猴桃AcWRKY70基因在不同处理条件下的表达模式分析

2.6.1AcWRKY70基因组织表达模式分析 通过qRT-PCR技术分别对红阳和徐香2个品种中AcWRKY70基因在根、茎、叶、花不同组织中相对表达量进行分析，结果表明，AcWRKY70基因在徐香和红阳(图6)2个品种中基因相对表达量由高到低均为叶>茎>花，叶片中AcWRKY70基因相对表达量最高，显著高于茎、花中的基因表达量(P<0.05)。

不同小写字母代表不同处理存在显著差异(P<0.05)。图7同。Different lowercase indicate significant difference in different treatments， P<0.05．The same asFig.7.

2.6.2AcWRKY70基因在病原菌处理、病原菌与水杨酸预处理、病原菌与茉莉酸甲酯预处理下的表达模式分析 实时荧光定量分析Psa、SA+Psa以及MeJA+Psa处理下不同抗性品种猕猴桃AcWRKY70基因表达水平的变化情况，结果表明，在Psa处理下的，0 h高感病品种红阳猕猴桃中AcWRKY70基因相对表达量迅速上升至正常生长叶片的3.18倍，抗病品种徐香猕猴桃中AcWRKY70基因相对表达量上升至正常生长叶片的1.85倍；6 h后2个品种中AcWRKY70基因相对表达量均呈现先升高后下降的趋势(图7-A)，特别是抗病品种徐香猕猴桃在12 h基因相对表达量急剧升高至峰值，为正常生长叶片的80.58倍，在24，48 h基因相对表达量虽呈降低趋势，但仍处于较高水平，分别为正常生长叶片的13.68，8.65倍；而高感病红阳品种中AcWRKY70基因相对表达量始终维持在较低水平，除了在48 h基因相对表达量为正常生长叶片的3.03倍，Psa处理下高感病品种红阳AcWRKY70基因相对表达量始终低于抗病品种徐香(除0 h之外)(图7-A)。

在SA+Psa处理下，0 h高感病品种红阳中AcWRKY70基因相对表达量为正常生长叶片的1.95倍，抗病品种徐香中AcWRKY70基因相对表达量迅速升高至正常生长叶片的4.01倍；之后徐香AcWRKY70基因相对表达量均呈现先升高后下降的趋势，在12 h基因相对表达量达到最大，为正常生长叶片的39.91倍，红阳AcWRKY70基因相对表达量在6～72 h内波动变化，72 h达到最大，为正常生长叶片的2.95倍，且该处理下0，6，12，24 h红阳基因相对表达水平低于徐香(图7-B)。

在MeJA+Psa处理下，6 h高感病品种红阳中AcWRKY70基因相对表达量为正常生长叶片的1.09倍，抗病品种徐香中AcWRKY70基因相对表达量迅速升高至正常生长叶片的5.42倍；之后徐香AcWRKY70基因相对表达量呈现先升高后下降的趋势，12 h基因相对表达量达到最大，为正常生长叶片的42.22倍，红阳AcWRKY70基因相对表达量在6～72 h内波动变化，24 h达到最大，为正常生长叶片的2.66倍(图7-C)。

3 结论与讨论

近年来，WRKY转录因子由于其参与植物生长发育多个过程、生物和非生物胁迫反应及植物天然免疫过程(包括微生物或病原体相关分子模式触发免疫反应(MTI或 PTI)和诱发免疫反应(ETI))而被广泛关注[4，11-12]，然而，关于猕猴桃WRKY转录因子在溃疡病胁迫反应中的响应机制报道较少。

胁迫反应相关基因的诱导表达主要发生在转录水平，植物特异性转录因子家族就是大量参与植物胁迫响应诱导特定应激相关基因表达的重要部分[24]。大量研究表明，WRKY转录因子家族参与了受体介导的过程从而诱导胁迫响应相关基因表达[4]。研究表明，在已报道的72个拟南芥WRKY基因中，有49个WRKY基因能够被猕猴桃溃疡病致病菌不同程度调控表达[25]。本研究表明，猕猴桃溃疡病致病菌侵染猕猴桃后，在抗病品种徐香中Psa诱导AcWRKY70基因迅速表达；而在高感病品种红阳中只在0，48 hAcWRKY70基因表达量被上调，可见，AcWRKY70基因在响应猕猴桃溃疡病胁迫反应中发挥了作用。值得注意的是，在抗病品种徐香中AcWRKY70基因强烈响应Psa胁迫，表达量急剧升高，远高于感病品种中基因表达量，这可能与不同品种间抗病性、抗病机制存在差异有关，AcWRKY70基因可能通过诱导抗病相关基因的表达从而提高徐香猕猴桃的抗病性。这与烟草抗病与感病品种中WRKY2、WRKY11基因的表达情况类似，当烟草受黄瓜花叶病毒侵染后，烟草抗病品种台烟8号中WRKY转录因子表达量增加，而感病品种K326中WRKY转录因子未受明显诱导[26]。除此之外，AcWRKY70基因在抗病品种中可能主要参与了植物对病原菌的早期抗性反应，这与烟草中WRKY转录因子表达情况也一致。

胁迫响应往往与激素信号相关，WRKY转录因子也是复杂的植物激素信号网络中的一个重要部分。研究表明，拟南芥中属于WRKY转录因子第Ⅲ类的WRKY70和WRKY46基因能够被SA和病原体诱导大量表达从而提高植物抗病性[27]。本研究中，经过Psa处理后抗病品种徐香与高感病品种红阳AcWRKY70基因均被上调表达，这与AcWRKY属于WRKY转录因子第Ⅲ类家族特征一致[28]；SA+Psa处理0 h抗病品种徐香AcWRKY70基因相对表达水平高于高感病品种红阳中该基因相对表达水平，表明AcWRKY70基因表达水平受到SA处理的影响，且不同抗性品种间该基因调控机制方面存在差异。研究表明，经过SA预处理的海沃德猕猴桃叶片接种Psa后， Psa定殖率仅为只接种Psa猕猴桃叶片的46%[22]。在MeJA+Psa处理0 h，抗病品种徐香AcWRKY70基因相对表达水平也高于高感病品种红阳中该基因相对表达水平，表明茉莉酸甲酯预处理对于AcWRKY70基因的表达具有调控作用，基因表达水平的变化可能与SA预处理、MeJA预处理降低了Psa在猕猴桃叶片上的定殖率有关；这与辣椒CaWRKY27转录因子响应SA、JA信号提高抗病性一致[29]；在高感病品种红阳中AcWRKY70基因相对表达量始终处于较低水平，这可能与AcWRKY70转录因子在不同抗病性品种间调控机制不同有关，其可能是导致猕猴桃高感病品种红阳和抗病品种徐香抗性差异的原因之一。

本研究克隆并分析不同抗性猕猴桃品种中AcWRKY70基因在Psa、SA+Psa、MeJA+Psa处理条件下的基因表达情况，结果表明，AcWRKY70基因受Psa诱导表达且在不同抗病性猕猴桃品种间的作用机制存在差异，SA、MeJA预处理可以提高抗病猕猴桃品种的抗病能力，但具体机制仍需继续探究，今后将进一步探索AcWRKY70转录因子在抵御猕猴桃溃疡病中的调控机制，为AcWRKY70基因的抗病功能的研究和应用奠定基础。