普通白菜CYP同源基因克隆与表达分析

侯瑞泽，侯玉翔，许小勇,李 璿，李梅兰

(山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801)

普通白菜(Brassicarapassp.chinensisMakino)又称小白菜，属于十字花科芸薹属，具有味道优美、营养价值高、物美价廉等特点，因而受到人们的广泛关注，是我国重要的一种经济蔬菜[1-2]。植物开花是高等植物生长发育中的一个重要过程，意味着植物由营养生长转变为生殖生长[3]。这一过程受植物自身的遗传因子、发育状态、生理信号及外界环境因素的精确调控，是植物响应多种内在及外界环境的信号并整合的结果。正是这种内外因子协同调控的方式，能确保植物在最适合的时间开花，为后续植物生殖生长创造了良好的发育条件[4]。近年来有大量研究结果表明，植物有6条主要的开花调控路径，包括光周期途径[5]、春化途径[6]、环境温度途径[7]、赤霉素途径[8]、自主途径[9]、年龄途径[10]。植物激素是植物体内重要的活性信号分子，参与植物生长发育及细胞分化的调控过程。传统的开花素学说认为，成花素和赤霉素可作为开花素调控植物的开花过程，表明在成花过程中，植物激素的作用不可或缺。目前主要的5种植物激素中，生长素对于成花作用也有着至关重要的作用[11-13]。正是内外各方面因素的影响，交织形成了植物丰富且特殊的开花调控网络。

根据生长素代谢的相关报道[14-15]，生长素的合成分为依赖色氨酸和非依赖色氨酸2种途径，依赖性途径又划分为4条支路，其中，吲哚乙醛肟(IAOx)途径是十字花科植物中最重要的一条途径，在拟南芥中对吲哚-3-乙酸 (Indole-3-acetic acid，IAA)合成起到辅助作用，且IAOx是IAA和次生代谢物，包括吲哚族硫苷(Glucosinolates)、芸薹葡糖硫苷(Glucobrassicin，GB)和植保素(Camalexin)的共同前体。且因在拟南芥中CYP79B蛋白是催化生长素合成反应中的主要酶，故该途径又称为CYP79B途径。

CYP79B2酶是十字花科植物IAA合成过程中的重要物质，其可通过催化生成IAOx进入吲哚族硫苷和IAA代谢途径。前人研究表明[16]，CYP79B2基因的过表达会使植物体内IAA含量明显提高，且参与色氨酸代谢的CYP79B2基因在1 μmol/L 2，4-D上生长的拟南芥中被诱导表达，导致吲哚族硫苷积累量增加，说明CYP79B2基因与IAA的代谢合成密切相关。目前，对于CYP79基因家族的研究多集中在硫代葡萄糖苷(简称硫苷)、生氰糖苷类和腈类的生物合成关键酶的表达调控，其中硫苷通常被视为十字花科植物中具有抗病虫功能的重要次生代谢物。且有研究报道表明[17-18]，CYP基因家族在不同物种中的表达模式存在差异[19-20]，对于CYP79B2基因与IAA合成的分子机制也仅在拟南芥、大白菜等植物中得以研究。因此，可以将普通白菜作为研究对象，以IAA代谢的前体物吲哚乙醛肟为切入点，阐明CYP79B2基因与IAA的合成代谢模式，为十字花科植物生长发育调控及其对开花机理研究提供依据。

本试验以75#普通白菜为材料，通过RT-PCR方法克隆普通白菜拟南芥CYP79B2的同源基因，利用生物信息学方法对其序列及蛋白结构进行分析，并通过荧光定量实时PCR对基因BrcCYP79B2-1不同组织器官和发育时期的表达进行分析，旨在为后续对普通白菜的开花调控及病虫防治机理研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为普通白菜品系75#，该品系在适宜环境下种子露白后，4 ℃低温处理20 d即可完成春化，春化结束后移栽到穴盘中，并分别对移栽后0，10，15，16 d的植物组织茎尖进行取样，样品分别标记为V0、V10、V15、V16。取样质量为0.1 g，液氮速冻后于-80 ℃冻存备用。

1.2 总RNA提取及cDNA第1链的合成

将移栽10 d的植物组织茎尖样品在液氮中迅速研磨成粉末后，按照RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN，DP432)试剂盒提取RNA，并冻存于-80 ℃冰箱。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa，RR037Q)试剂盒将其反转录成第1条cDNA，作为克隆基因所需要的模板。

1.3 BrcCYP79B2-1的基因克隆

利用大白菜数据库(http：//brassicadb.org)查找BrcCYP79B2-1的序列，用Primer 5.0在线软件对基因设计克隆引物，序列为F：ATGAACACTCTTACC

TCAAACTCTTCG；R：CTACTTCACCGTCGGGTAAAGA。以1.2获取的cDNA为模板，使用TaKaRa LA Taq®(TaKaRa：RR02MQ)试剂进行PCR扩增，其反应体系为(共50 μL)：TaKaRa LATaq0.5 μL，LATaqBuffer Ⅱ(10×)5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)8 μL，正、反引物(10 μmol/L)以及cDNA模板各1 μL，无菌水33.5 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；最后72 ℃终延伸5 min，4 ℃保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，确认条带大小正确且无杂带后进行胶回收。

将胶回收的DNA产物用pUCm-T Vector PCR Products Cloning Kit(Sangon Biotech，B522213)在PCR仪中与T-载体连接12 h。后转化至大肠杆菌DH5α Competent Cells中，挑选阳性克隆进行PCR，送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.4 生物信息学分析

使用DNAMAN软件对测序序列翻译成氨基酸，以NCBI数据库为基础，进行氨基酸序列多重比对，并构建系统进化树。然后采用在线工具Protparam分析氨基酸的理化性质。

1.5 基因的表达分析

为了更清楚地了解BrcCYP79B2-1的功能，将普通白菜75#品系的根、茎、叶、花蕾和果荚进行取样，用qRT-PCR的方法研究基因在不同器官中的表达情况。BrcCYP79B2-1的特异性引物序列为F：CTCCGTGAAGCTTTCCGTCT；R：AACTTTTGGGTTACGGCCCA。

2 结果与分析

2.1 基因BrcCYP79B2-1的克隆和序列分析

经琼脂糖凝胶电泳验证PCR扩增产物，结果发现，目的条带大小与实际大小一致(图1)，可进行后续的测序，由测序结果可知，BrcCYP79B2-1片段大小为1 623 bp。

M.DNA Marker；1—3.BrcCYP79B2-1。

使用DNAMAN软件对BrcCYP79B2-1进行蛋白质翻译，结果表明，BrcCYP79B2-1共编码540个氨基酸(图2)。

图2 BrcCYP79B2-1基因及氨基酸序列Fig.2 Gene and amino acid sequence of BrcCYP79B2-1

对BrcCYP79B2-1编码蛋白质的理化分析结果表明，推测分子质量为60.849 73 ku，其理论等电点为8.71，脂肪指数为86.33，亲水性的平均值是-0.174；带负电荷的残基总数是58，带正电荷的残基总数为64，不稳定性指数(Ⅱ)为35.30，此蛋白质分类也是稳定的。

2.2 生物信息学分析

2.2.1 氨基酸多重序列比对 利用DNAMAN软件对BrcCYP79B2-1基因的氨基酸序列同相近的物种进行多重比对，结果表明，克隆基因BrcCYP79B2-1氨基酸序列同大白菜(Brassicapekinensis)、甘蓝型油菜(Brassicanapus)、甘蓝(Brassicaoleraceavar.capitata)、芜菁(Brassicarapa)、花椰菜(Brassicaoleraceavar.botrytis)、萝卜(Raphanussativus)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)具有较高的同源性，同源性分别达到98.70%，98.89%，98.52%，99.52%，98.33%，96.85%，93.16%(图3)。

图3 BrcCYP79B2-1的氨基酸序列多重比对结果Fig.3 Multiple alignment results of the amino acid sequence of BrcCYP79B2-1

2.2.2 蛋白质亲缘关系分析 为了进一步了解BrcCYP79B2-1编码蛋白与其同源蛋白在不同植物之间的进化关系，使用DNAMAN软件构建这2个蛋白在不同植物物种间的系统进化树，结果表明，与BrcCYP79B2-1编码蛋白亲缘关系最近的是甘蓝型油菜同源蛋白，并且同大白菜、花椰菜和芜菁属于一个小分支；与萝卜和拟南芥亲缘关系较近，与茶花(Camelliasinensis)、胡杨(Populuseuphratica)、黄麻(Corchoruscapsularis)等植物的亲缘关系较远(图4)。

图4 BrcCYP79B2-1同源蛋白的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of BrcCYP79B2-1 homologous protein

2.2.3 蛋白质结构预测结果 使用SOPMA预测蛋白质的二级结构，结果显示(图5)，BrcCYP79B2-1编码蛋白的主要二级结构是α-螺旋(47.41%)和无规则卷曲(37.04%)。使用Swissmodel预测蛋白质的三级结构如图6所示，其三级结构模型与二级结构分析结果吻合。

图5 BrcCYP79B2-1蛋白质二级结构预测Fig.5 Protein secondary structure of BrcCYP79B2-1

图6 BrcCYP79B2-1蛋白质三级结构预测Fig.6 Protein tertiary structure prediction of BrcCYP79B2-1

2.3 基因表达分析结果

为了了解BrcCYP79B2-1在普通白菜不同器官与不同生育期中的表达情况，使用qRT-PCR的方法对其进行定量分析，结果发现(图7)，BrcCYP79B2-1基因在植物花蕾中的表达量最低，在茎中的表达量较低，在叶片中的表达量较高，而在根中的表达量最高。

不同小写字母代表相对表达量在0.05水平上差异显著。Different lowercase letters represent significant differences in relative expression at the 0.05 level.

从图8可以看出，经过低温处理后，茎尖部位该基因的表达量都表现出先急剧上升，在移栽10 d后达到顶峰，而后逐渐下降，移栽15 d后处于相对较低的表达水平，有利于促进花芽分化。

图8 BrcCYP79B2-1在不同发育时期茎尖部位的表达Fig.8 Expression of BrcCYP79B2-1 in shoot apex at different developmental

3 结论与讨论

CYP79B(IAOx)途径又称吲哚乙醛肟途径，是十字花科植物合成生长素的重要途径[21]。吲哚-3-乙酸是十字花科植物生长发育的重要激素，而CYP79B2/B3基因催化生成的吲哚乙醛肟(IAOx)是这2条代谢途径的前体物质[22-23]。有研究表明[24-25]，CYP79B2基因的过表达会导致植物体内IAA含量升高，而IAA含量的增加也会形成反馈，使得CYP79B2表达水平提高。且CYP79B2表达受病原体感染和机械损伤诱导，在根、叶和花中表达最高。本试验通过实时荧光定量研究在普通白菜不同器官中的表达情况，这个基因在根和叶中表达量较高，这与前人的研究结果相符[26]。而根据在菘蓝中克隆到的基因IiCYP79B2的表达分析表明[27]，其在不同组织中的表达量由高到低依次为叶>茎>果>花>根，这也说明CYP79B2基因在不同物种的表达存在明显差异。另有研究表明[28]，CYP79B2/B3的表达主要集中在顶端分生组织、下胚轴、子叶叶脉、真叶叶脉、根和根尖，而这些都是生长素的主要合成和运输部位，这也证实了其在十字花科植物生长素合成过程中的作用；研究还认为，CYP79B2/B3的表达可能与MYB转录因子有关，但还需进行进一步研究。

BrcCYP及其同源基因在花发育过程中起着重要的作用，普通白菜BrcCYP的同源基因所编码的蛋白与十字花科蔬菜，如大白菜和萝卜等具有较高的同源性，也进一步说明了十字花科蔬菜间较近的亲缘关系。且近年来，越来越多的资料表明[29-31]，生长素对植物开花有着重要影响，如王小权等[32]研究认为，其内源因子与花序发育的内源因子有关。徐振朋等[33]研究认为，生长素与其他激素的平衡对于成花有着重要的调控作用。邓全恩[34]研究认为，生长素可以调控油菜花的花期、开花样式和花粉活力，并使花芽内部碳水化合物含量、激素含量、基因表达呈现与花器官发育进程一致的改变。这些都说明，生长素在成花过程中发挥了重要的作用。而不同低温时间处理下，BrcCYP79B2-1的表达量有所不同，且有峰值，其表达对于低温的响应，也将BrcCYP79B2-1的作用与植物开花调控关联起来，为植物开花机制研究提供思路，也为后续功能验证提供理论基础。

本试验通过研究CYP79B2同源基因BrcCYP79B2-1的表达模式及其生物学信息分析，结果显示，该基因的表达与低温春化有关，可以影响花芽分化。这对于研究十字花科植物生长发育调控机制具有重要意义。本研究以RT-PCR的方法从普通白菜中克隆到CYP79B2同源基因BrcCYP79B2-1，并通过与其他物种的同源蛋白进行序列多重比对和亲缘关系分析，结果表明，克隆到的基因BrcCYP79B2-1的确是普通白菜中的CYP79B2同源基因。采用qRT-PCR的方法对普通白菜不同器官和时期BrcCYP79B2-1的表达量进行分析，结果发现，BrcCYP79B2-1在根中的表达量最高，叶中次之，而在花蕾中的表达量最低，在低温处理10 d表达量最高。本试验结果为后续研究十字花科植物开花机制的研究奠定了一定理论基础。