高压二氧化碳在肉品杀菌保鲜中的应用研究进展

牛力源，张艺林，刘静飞，吴梓浩，张志坚

（1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南郑州 450001；2.河南省冷链食品质量安全控制重点实验室，河南郑州 450001）

肉及肉制品营养价值高，不仅能够提供相对丰富易吸收的铁元素，还是人类优质蛋白质和维生素B（包括植物性食品中缺乏的维生素B）的主要来源。然而，肉品在屠宰、冷冻、切割、加工、储存等过程中容易受到各种微生物的污染，导致肉质腐败，甚至引发食源性疾病。2009～2015年间美国食源性疾病爆发监测系统（FDOSS）报告了5760起食源性疾病，其中，导致疫情相关疾病最多的食品类别是鸡肉（12%）和猪肉（10%）。2017年欧洲共报告了5228起食源性疫情，沙门氏菌是所有食源性病原体中检测到的最常见病原体，主要与肉类、肉制品、蛋类和蛋制品有关。由此可见，在消费食品中占很大比例的肉及肉制品，其质量安全仍然是一个关键的公共卫生问题。

为了确保肉品的质量和安全，必须采用适当的肉品保鲜技术。目前用于肉类保鲜的传统方法主要包括添加化学防腐剂、冷冻、真空包装和蒸汽杀菌等。然而，随着人们对食品营养品质要求的不断提升，诸如超高压、超声波、冷等离子体等新型非热杀菌技术在食品加工保鲜领域的应用正受到世界范围的广泛关注。与传统热杀菌相比，非热杀菌技术能耗较低，在保障食品安全的同时，也能较好的保存加工原料的固有营养成分和新鲜度等，使得杀菌过程导致的品质劣变降到最低。

高压二氧化碳（High pressure carbon dioxide,HPCD）是一种新型非热杀菌技术，其在果蔬、肉品、谷物、液体食品等加工、贮藏与保鲜中的应用研究广泛。该技术将二氧化碳（CO）与压力相结合，使用间歇、半间歇或连续处理设备，在相对温和的温度（＜60 °C）和压力（＜50 MPa）条件下进行处理，形成高压、酸性环境，在达到显著杀菌和钝酶效果的同时，最大限度保持食品原有的营养、色泽、质构与风味，在食品微生物控制领域中具有潜在的应用前景。CO的抑菌作用首次在1927年发现，其抑菌作用与CO的浓度呈正相关。1951年Fraser研究高压气体减压破裂细菌时发现，相比于高压氮气和高压一氧化二氮，压力状态下的CO具有更加显著的杀菌效果。在20世纪80年代末期，一批日本学者展开了使用高压气体作为热杀菌替代方法的相关研究。经研究发现，在相同条件下，加压CO的杀菌效果要优于其它气体介质。此外，CO具有化学惰性、无腐蚀性、高挥发性、不可燃、无毒、无味等优点，且价格低廉、易取得。因此，HPCD技术受到了食品加工领域研究学者的广泛关注。

本文综述了近年来单一HPCD处理及其与其它方法协同作用对肉品中微生物的杀灭效果、肉品理化品质、质构特性和微生物稳定性的影响研究，以期为HPCD技术在肉品杀菌保鲜中的应用提供理论支持。

1 HPCD杀菌机制研究

1.1 HPCD使微生物营养体失活的机制

基于CO的物理和化学性质，国内外关于HPCD杀菌机制的推测主要为细胞机械性破裂和生理性失活两种观点。在关于HPCD技术的早期研究中，微生物细胞被认为是在快速减压作用下破裂的。由于加压后CO进入微生物细胞内部导致细胞内外不平衡的压力差，细胞可能在瞬间减压时发生机械性破裂。但是，也有研究表明增加减压速率并不能促进微生物细胞的失活，大多数细胞似乎在加压阶段就已经被灭活，因为部分微生物在HPCD处理后完全失活而细胞仍然完整。虽然机械性破裂可能是某些细胞死亡的原因之一，但HPCD技术的致死效应主要还是与其它生理机制有关（图1）：a.CO与细胞质膜或细胞器膜间的高亲和力可造成膜的结构和功能变化，使生物膜的渗透性和流动性增加；b.CO的扩散性和溶解性有助于CO与水分子反应解离出H，降低细胞内外pH，破坏细胞质pH稳态和膜电位动态平衡；c.HPCD处理使蛋白质从纯水相迁移至CO/水界面，蛋白质核心疏水区域释放至CO相，表面亲水基团残基移至水相，蛋白质构象发生改变，导致部分酶活性下降甚至完全失活；d.CO分子及（或）其解离出的HCO和CO可能使细胞膜及细胞内无机电解质发生沉淀，导致细胞膜结构破坏及细胞内电解质平衡紊乱；e.CO、HCO、CO作为反应物或产物的细胞代谢活动可能会受到促进或抑制，如尿素循环代谢等。尽管国内外研究学者对于HPCD技术的杀菌机制已有一定理解，但目前仍未完全阐明，HPCD胁迫下影响微生物活性的关键代谢环节仍需进一步研究。

图1 HPCD失活微生物营养体的机制示意图Fig.1 The schematic diagram of inactivation mechanism of HPCD against microbial vegetative cells

1.2 HPCD使微生物芽孢失活的机制

目前关于HPCD失活微生物芽孢的机制主要有两种假说。一种是微生物芽孢首先被激活、萌发，然后在HPCD处理下失活。凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌芽孢经HPCD和90 °C高热依次处理后完全失活，Watanabe等分析这可能是由于HPCD处理降低了细菌芽孢的耐热性，因此，HPCD的萌发作用被认为是其导致芽孢失活的主要原因之一。然而，Rao等通过对失活枯草芽孢杆菌芽孢的形态观察以及分子生物学分析发现，HPCD处理并未诱导芽孢萌发，而是增加了芽孢内膜和皮层的通透性，破坏了芽孢结构，导致核心物质如吡啶二羧酸（DPA）和金属离子等的释放，最终提高了芽孢的热敏性，这是HPCD失活细菌芽孢的另一种假设机制。另外，芽孢失活也可能与CO溶解于水溶液导致芽孢内部pH降低或某些酶失活有关。虽然近期研究结果似乎更支持“结构破坏导致芽孢失活”这一假设机制，但HPCD究竟如何作用于芽孢并破坏其内膜仍未十分清楚，HPCD对芽孢内膜特性的影响还需要进一步研究。

2 HPCD处理肉品的杀菌效果研究进展

2.1 单一HPCD处理肉品的杀菌效果研究

单一HPCD技术应用于肉品微生物安全控制的相关研究见表1。多项研究表明，HPCD处理能够有效降低生肉中的致病菌和致腐菌。生猪肉中的嗜温菌在 25～40 °C 下经 6～16 MPa HPCD 处理 5～60 min后大约减少了1.0～3.0 lg CFU/cm，杀菌效果随温度升高和处理时间的延长而增强。HPCD处理对冷却猪肉中的大肠杆菌、假单胞杆菌以及细菌总数也同样具有显著的杀灭效果，而且杀菌速率随时间呈现由快到慢的动力学曲线。相反，HPCD对牛肉糜中的热杀索丝菌的灭活效率随着处理时间的增加呈现“先慢后快”的动力学现象，这可能与革兰氏阳性菌对HPCD的抗性更强有关。Jauhar等报道了在45 °C下，经14 MPa HPCD处理40 min后，鸡肉中总菌数、酵母菌和霉菌数分别减少了2.27、3.07 lg CFU/g。此外，HPCD技术还被应用于腌渍肉、香肠等多种肉类制品的杀菌保鲜研究中。在60 °C下经20 MPa HPCD处理30 min后，生羊肉香肠中需氧菌、肠杆菌、乳酸菌和微球菌的数量分别显著减少了2.52、＞5.72、＞4.09和 2.09 lg CFU/g。使用 HPCD 技术处理生鲜调理鸡肉和腌渍猪肉，对细菌的灭活效果同样显著。Schultze等将HPCD作为热杀菌的替代技术对牛肉干进行杀菌处理，结果发现湿润的CO气体（被水饱和的气态 CO，5.7 MPa、65 °C）使接种在牛肉干表面的干燥大肠杆菌和沙门氏菌显著减少超过5.0 lg CFU/g，而且还证实了对于低水分活度食品上的革兰氏阳性菌和阴性菌，气态CO的杀菌效果比超临界状态CO更为有效。

表1 单一HPCD处理对肉品的杀菌效果研究Table 1 Studies on the antimicrobial effect of HPCD alone treatment on meat and meat products

尽管HPCD技术能够有效灭活各种微生物营养体（＜30 MPa，20～40 °C），但很难在温和条件下（20～40 °C）灭活细菌芽孢。因此，多数研究将HPCD技术与其他处理方法相结合，以增强对芽孢的灭活效果。Karajanagi等将HPCD的处理温度提高到75 °C，枯草芽孢杆菌芽孢减少了7 lg CFU/mL。Gomez-Gomez等将HPCD与高场强超声波技术（high power ultrasound，HPU）结合处理显著提高了HPCD对丁酸梭状芽胞杆菌芽孢的灭活效果，但对黑曲霉孢子则没有展现出协同作用。HPCD联合乙醇、乙酸、过氧化氢等化合物处理也可提高其对芽孢的灭活效果。李凤娟等应用HPCD技术灭活取自猪肉糜的枯草芽孢杆菌芽孢，发现在各处理参数中，CO压力对HPCD失活芽孢效果的影响最大，其次是保压时间。此外，在添加杀菌剂和萌发诱导剂后，枯草芽孢杆菌芽孢对HPCD处理的抗性明显降低。然而，目前关于HPCD技术直接失活食品体系中食源性细菌芽孢的研究还很有限。

2.2 HPCD联合其它非热技术对肉品的杀菌效果研究

为了提高杀菌效率，多项研究将HPCD与其它加工方法相结合对肉品进行加工处理（表2）。Spilimbergo 等应用 HPCD（12 MPa）联合 HPU（10 W）对接种有单增李斯特菌的干熏火腿杀菌处理5 min后，发现在22 °C下二者没有展现出协同效应，但当处理温度升至35 °C时，HPCD协同HPU的杀菌效果比单一HPCD处理更为有效。HPCD技术联合HPU在45 °C下处理熟火腿后，嗜温菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌数量也显著下降，而单一HPCD处理若要达到对熟火腿中嗜温菌和乳酸菌相同的灭活效率，则需要延长处理时间。这可能是由于在该温度下细胞膜的流动性增加，而且加压CO此时为超临界流体状态，具有高扩散率和强溶剂能力，能够更快地穿透细胞膜，并容易从细胞质中提取出细胞成分。Morbiato等还报道了HPCD与HPU联合干燥生鸡胸肉，不仅出水速度快、复水能力高，还能有效杀灭生鸡胸肉表面接种的沙门氏菌。在HPCD与HPU的联合处理中，CO作为一种高密度流体传输超声波，在其加压系统中，超声会诱导微搅拌和溶剂空化，导致微生物细胞壁膜破损；同时，超声波能够促进溶剂扩散，引起界面湍流，从而降低CO传质的外部阻力，因此，二者结合处理会展现出良好的协同杀菌效果。Castillo-Zamudio等还发现，将HPCD+HPU（42 W）与生理盐水（0.85% NaCl）结合使用可以明显提高HPCD+HPU对干熏火腿中大肠杆菌的杀菌效率，这可能是由于生理盐水的加入引发了更强的空化效应。HPU单独应用时杀菌效果虽然显著，但在高强度超声下大量能量会以热能形式耗散，造成浪费，同时也会缩短仪器的使用寿命。将HPCD与HPU结合应用于肉品的生产加工，在有效提升杀菌效率的同时，还可以降低能耗和资金投入。此外，HPCD结合肉品添加物也具有良好的协同杀菌效果。HPCD（12 MPa）联合 3% 有机酸（乳酸或醋酸）在 35 °C 下处理生鲜猪肉30 min后，大肠杆菌、单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的失活率比单一HPCD或有机酸处理更高。González-Alonso等发现HPCD结合纯芫荽精油（0.5% v/w）处理鸡肉表面大肠杆菌也显示出了良好的协同杀菌效果。

表2 HPCD联合其它非热技术对肉品的杀菌效果Table 2 Antimicrobial effect of HPCD combined with other non-thermal technology on meat and meat products

微生物的生长是决定肉品货架期长短的主要因素之一。尤其是低温肉制品，其热加工温度低，杀菌不彻底，加之肉品本身水分活度高、营养成分多、pH高，操作不当污染后很容易引起微生物的生长和繁殖，导致肉品腐败变质。单一HPCD处理肉品时需要较高的CO压力、较长的处理时间或较高的处理温度来提升其杀菌效果，这不仅会增加对设备的资金投入，降低加工效率，还可能会影响食品品质。上述研究发现，将HPCD技术与HPU、有机酸、精油等方法相结合对各类肉及肉制品进行杀菌处理，不仅展现出了显著的协同增效效应，还规避了各杀菌方法单独应用时的弊端。由此可见，在肉品加工领域中HPCD技术与其它抗菌方法累加或交互应用的综合杀菌保鲜技术可能比单一HPCD技术更具前景。

3 HPCD处理对肉品品质及微生物稳定性的影响

虽然HPCD技术能够有效杀灭各类肉及肉制品中的微生物，但由于CO对固体食品的穿透能力较弱，需要较长的处理时间和较高的处理温度才能获得微生物安全的肉类食品，这可能会对食品的品质特性产生不良影响。HPCD技术及其联合其它方法处理对肉品品质特性的影响见表3。

表3 单一HPCD或联合其它非热技术对肉品品质特性的影响Table 3 Effects of treatment with HPCD alone or combined with other non-thermal technology on the quality attributes of meat and meat products

3.1 HPCD处理对肉品理化特性的影响

3.1.1 硫代巴比妥酸反应物（TBARS） 脂质氧化与食品品质劣变有关，是肉品氧化变质的主要原因。TBARS值是评价脂质氧化程度的常用指标，肉品中TBARS值超过2.0 mg/kg可能会产生不良风味。刘芳坊等在常温下对冷却猪肉进行HPCD处理的研究中发现，短时间处理对防止肉品氧化并没有效果，随着处理时间的增加，TBARS值有所上升；但当处理时间超过30 min后，TBARS值反而下降，这可能是由于脂肪氧化酶在HPCD长时间作用下活性受到抑制所致。此外，在贮藏期间，经HPCD处理肉品的TBARS值会随着贮藏时间的延长而增加。其中，经HPCD处理的猪肉糜在贮藏3 d后，TBARS值比未处理组高出27%，HPCD处理对猪肉糜似乎具有助氧化的作用。当HPCD与2.5%或5%迷迭香粉末联合应用时，与单一HPCD处理组相比，TBARS值则分别显著降低了8.2%和9.8%，肉品氧化程度得到缓解，但仍高于未处理组。

3.1.2 挥发性盐基氮（TVB-N） TVB-N值是衡量肉品新鲜程度的重要参考指标之一，反映肉中微生物的繁殖状况和蛋白质的分解情况。闫文杰等研究报道了随着贮藏时间的延长，经HPCD处理的冷却猪肉的TVB-N值的增加与未处理样品相比相对缓慢，贮藏10 d后，未处理样品的TVB-N值升高至14.93 mg/100 g，经21 MPa HPCD处理的样品TVB-N值则仅升高至7.04 mg/100 g，表明HPCD处理可延缓冷却猪肉的腐败变质，这与HPCD处理减少了贮藏肉品的初始菌数有关。经 HPCD（18 MPa，30 °C，30 min）处理的预包装红烧肉在4 °C下贮藏期间（90 d）TVB-N值也随着时间的延长而增加，但低于高温处理（121 °C，30 min）的红烧肉的 TVB-N 值，这可能是高温处理导致红烧肉中的蛋白质分解所致。在贮藏研究中，HPCD联合迷迭香粉末处理的猪肉糜的TVB-N值在7 d的贮藏过程中逐渐升高，但仍显著低于未处理组，各处理组间无显著差异。在贮藏7 d后，单独HPCD处理组的TVB-N值较HPCD联合5%迷迭香粉末处理组高出2.27 mg/100 g，协同处理的肉品TVB-N值增加速度较慢，表现出了更好的保鲜效果。

3.1.3 pH pH是决定肉品品质如保水能力、嫩度、颜色、风味和货架期等的关键因素。研究表明，在7.0～15.2 MPa下HPCD处理的生猪肉和生鸡肉的pH变化不大。然而当压力升至21 MPa时，冷却猪肉的pH则显著降低，可能是由于在高压条件下，CO更容易扩散进入肉中，形成碳酸，使肉的pH降低。相反地，在35 °C下经13.79 MPa的HPCD处理2 h后，猪肉糜的pH相比于未处理组显著升高了0.15，作者认为这可能是在加压处理期间蛋白质的展开掩盖了氨基酸的酸性基团所致；而在冷藏5 d后猪肉糜的pH却显著低于未处理样品，可能与贮藏过程中需氧菌的繁殖有关。此外，HPCD结合HPU对干熏火腿表面的酸度和pH也没有显著影响。但是，HPCD处理温度和时间对羊肉香肠的pH有显著的交互作用，羊肉香肠的pH会随着HPCD处理时间（15～60 min）或处理温度（50～60 °C）的增加而增加。这与生猪肉的研究结果不一致，可能是由于处理温度不同，肉类蛋白在加热过程中的热变性会使其pH增加。

3.1.4 保水性 肉的保水性是衡量肉品品质和经济价值的重要指标之一。肉品的保水性与CO压力、处理时间和处理温度有关。Choi等发现猪背最长肌在 31.1 °C 下经 HPCD（7.4～15.2 MPa）处理10 min对其保水性并没有影响，相似条件下HPCD处理也没有影响鸡肉的保水性。在恒温下CO压力从10 MPa升至30 MPa也不会增加牛肉糜的水分流失，但将温度从35 °C提升至50 °C后，水分流失则明显增加（16.5～23.0 g），这表明温度对肉品保水性的影响比CO压力更重要。相反地，Szerman等发现，恒温下HPCD压力的增加（10～30 MPa）和处理时间的延长（2～25 min）均增加了羊肉香肠的重量损失和汁液损失。在55 °C、10 MPa下，将处理时间由2 min延长至25 min后，羊肉香肠的汁液损失显著增加了4.36%。不同HPCD处理参数对肉品保水性的影响似乎与肉品种类有关。此外，HPCD处理对贮藏期鸡肉和猪肉的保水性没有显著影响。

3.2 HPCD处理对肉品色泽的影响

HPCD和传统蒸煮技术一样，会显著改变生肉产品的色泽，使肉品外观接近于“熟肉”。冷却猪肉经HPCD处理后，一般会出现值（亮度值）显著增加，值（红度值）显著下降，肉品呈现灰白色。这可能是由于CO压力使肉中血红素释放，导致肌红蛋白和血红蛋白二级结构发生改变而变性，同时高压也可能会对还原（高铁肌红蛋白）或氧化（氧合肌红蛋白）肉品肌红蛋白的酶类产生影响，从而影响肉色的亮度和红度。这与HPCD处理生鸡肉和羊肉香肠的色泽结果相一致。另有研究发现，HPCD与高强度HPU（42 W）联合处理干熏火腿不会改变样品的亮度，但会增加其红度和黄度，而与较低强度（10 W）HPU结合使用则不会对火腿制品各色泽参数产生明显影响。

3.3 HPCD处理对肉品质构特性的影响

质构也是肉品的重要品质特性之一。在低于60 °C条件下，生鸡肉和香肠经HPCD处理后，各质构参数如硬度、弹性、胶着性等会显著增加。这可能由于高压导致肉品的紧实度增加，硬度趋于较高，所以肉质更接近于熟肉。同时，香肠的各质构参数值还会随HPCD处理时间的延长而增加，但当处理温度升至60 °C时，其弹性和粘结性不再受处理时间的影响。将HPCD与HPU结合处理火腿样品，不会改变火腿的硬度，并且在贮藏期间也不会发生显著变化，而未经处理的熟制火腿的硬度在货架期间则显著下降。HPU的超声强度（在10～1000 W/cm）是影响食品粘度和质地的一个重要因素，肉制品长时间暴露在高强度超声波（＞100 W/cm）下，会改变肌原纤维蛋白的构象，促使其由大分子聚合物解离为小分子蛋白，从而使肉质嫩化。Castillo-Zamudio等发现，高强度的HPU（42 W）与HPCD联合使用甚至会使干熏火腿软化。因此，HPCD与HPU的联合应用有助于维持甚至改善肉品的质构特性，延长肉品货架期。

综上所述，单一HPCD技术对肉及肉制品品质特性的影响取决于加工处理各参数如温度、时间、CO压力以及肉品的种类。高强度的HPCD处理虽然可以有效控制肉品中的微生物，但对肉品的理化品质和质构特性等会产生较大的不利影响。将HPCD技术与其它方法联用，可能有助于维持肉品品质。然而，针对不同的肉类产品，哪种协同方法更为适用，还需进行全面、深入的探索。

3.4 HPCD处理对贮藏期肉品微生物稳定性的影响

一般来说，货架期的结束取决于贮藏期间微生物的增殖情况，因此，研究HPCD处理肉品的微生物稳定性对食品安全也十分重要。HPCD处理（18 MPa，30 °C，30 min）的预包装红烧肉在贮藏第 90 d时菌落总数仍远远小于《GB 2726-2005熟肉制品卫生标准》中的要求（8×10CFU/g）。经 HPCD 处理（45 °C，14 MPa，40 min）的生鲜鸡肉中总菌数和酵母菌和霉菌数在低温贮藏期间逐渐减少，贮藏7 d后与未处理组相比分别减少了3.9和3.0 lg CFU/mL。Huang等同样报道了HPCD处理能够有效延缓冷藏猪肉糜中微生物的生长，联合5%迷迭香（w/w）处理的保鲜效果更优。此外，经HPCD和HPU联合处理（12 MPa, 45 ℃，15 min，10 W，间歇 2 min 或 25 MPa，46 °C，10 min，42±5 W）后贮藏在 4 °C 下的火腿制品其微生物稳定性也可以维持至少20 d。Spilimbergo 等也报道了干熏火腿经 HPCD（12 MPa，35 °C，5 min）联合 HPU（10 W，间歇 2 min）处理后，在 4周的冷藏期内都没有检测到单增李斯特菌。由此可见，虽然单一HPCD技术可以有效维持贮藏期间肉品的微生物稳定性，但将其与其它技术结合使用的杀菌保鲜效果更优。

4 结语与展望

HPCD技术作为一种新型的非热杀菌技术，在减少肉品中微生物数量、提高肉品安全性方面具有较大的应用潜力。然而，高压、高温以及长时间处理，会对肉品分子的相互作用和蛋白质构象产生影响，导致肉品颜色和结构变化。多项研究表明，将HPCD技术与其它非热处理（HPU、有机酸、植物精油等）联合应用，可以弥补其不足，在显著提高杀菌效率的同时，还可以最大限度地维持食品的原有品质，应用前景广阔。但是，目前关于HPCD联合技术在肉品加工中的应用研究有限，且主要集中于对杀菌效应和品质的影响研究，对联合杀菌机制的研究并不深入，各类肉品基质对联合杀菌效果的影响也未明确，最优处理参数还需探索。为了推动HPCD及其联合技术在肉品加工工业中的应用，今后的研究工作建议从以下几个方面展开：a.研究联合技术的协同杀菌机制，结合转录组学、代谢组学等多种组学技术从分子水平进行整合分析，同时进行生物学验证；b.研究探索适用于失活肉品中微生物芽孢的HPCD联合技术；c.研究肉品基质对各联合技术的干扰效应，开展联合杀菌在各类肉品中的应用实验，筛选所适用的肉品类型；d.建立各联合处理下适用于肉品中微生物的失活动力学模型，明确联合处理对肉品品质特性的影响规律，优化工艺参数；e.评估各联合技术最适用肉品的货架期和长期安全性，为推进HPCD技术在肉品工业中的应用提供理论依据。