大型奶牛养殖环境源大肠埃希菌毒力基因与系统进化分群

唐敏嘉，张雪婧，何卓琳，蒲万霞

(中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所 农业农村部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃 兰州 730050)

大肠埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)是肠杆菌科中的杆状革兰阴性菌，寄生于恒温动物包括人类在内的肠道后段，可以通过粪便或废水排入环境[1]。长期以来，环境水域中的E.coli被认为是粪便污染的一个指标。近年来，肠道菌特别是E.coli在主要病原菌中的优势逐渐显现[2]，动物源与人类的E.coli含有许多与肠外感染相关的毒力基因，而且这些毒力基因可以在人和动物之间水平转移，因此存在着人和动物共感染的潜在风险[3]。这给疾病的防治带来巨大的难题，也对公共卫生构成了巨大的威胁。E.coli具有复杂的系统发育结构和广泛的毒力基因，其基因组具有相当大的可塑性。E.coli的系统进化分群可分为A、B1、B2、C、D、E、F和隐支I[4-5]，寄居于消化道黏膜的肠内致病性或共生性E.coli主要为A或B1群，引起肠外感染的E.coli大都属于B2和D群。E.coli菌株的克隆具有遗传多样性，那些在表型上无法区分的被归入隐蔽分支I[6-7]。大肠杆菌毒力基因种类繁多，包括黏附素、毒素、铁摄取系统、脂多糖、多糖荚膜和侵袭素等，这些毒力基因通常位于致病岛(pathogenicity islands，PAIs)、质粒和其他可移动的遗传元件上[6]。高致病性毒力岛(high-pathogenicity island，HPI)被认为是E.coli的重要毒力基因之一，其核心功能区由fyuA和irp2两个重要的毒力基因组成，因此fyuA和irp2作为检测HPI的标志性基因[8]。与免疫逃避相关毒力基因主要包括荚膜、补体抗性蛋白和外膜蛋白酶，ompA、ompT和traT分别编码外膜蛋白、外膜蛋白酶以及补体抗体蛋白。铁是许多细菌生长所必需的，摄铁系统是细菌重要的生存机制，iroN编码铁载体受体，iucD编码NADPH依赖性赖氨酸N(6′)-单加氧酶，该酶与铁载体生物合成蛋白相关[9]。关于E.coli的传播动力学和克隆选择的潜在机制仍然知之甚少，有待进一步研究[10]。有关奶牛养殖环境源E.coli中系统进化分群和毒力基因的研究报道较少，本研究目的在于掌握甘肃大型奶牛养殖场环境源E.coli分离株的最新流行病学数据，对E.coli分离株进行分子研究，可为养殖场粪便管理和控制以及生产疫苗提供一定的理论指导。本研究应用PCR方法对奶牛养殖环境源E.coli进行系统进化分群鉴定和毒力基因检测，并分析不同时间、不同来源菌株的系统进化群分布、毒力基因携带情况及其相关性，以期探讨其遗传特性和流行特征。

1 材料与方法

1.1 菌株来源281株E.coli为本实验室2017—2019年分离自甘肃张掖地区2个大型奶牛养殖场运动场粪土和污水样品，该污水已经过无害化处理。样品采用五点采样法，在相对固定位置采集，由于奶牛场的养殖情况发生变化，所以每年采集样品数量略有不同。样品来源详细情况如表1所示。

表1 样品来源

1.2 主要设备和试剂PCR仪、全自动紫外凝胶成像仪(美国Applied Biosystems)；电泳槽和高压电泳仪(北京六一)、移液器和高速离心机(德国Eppendorf)；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)和DNA Marker均购自TaKaRa公司；LB肉汤和麦康凯琼脂购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 细菌基因组的提取及菌种再鉴定将复苏试验室保存E.coli菌株，接种至麦康凯培养基上，挑取单菌落在LB液体培养基中37℃培养至对数生长期，吸取1～2 mL菌液，12 000 r/min离心2 min，收集菌体，参照细菌基因组DNA提取试剂盒(天根DP302-02)说明书进行细菌基因组提取。以菌株DNA为模板，扩增菌株的16S rRNA序列，PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序、比对，对菌株进行再次鉴定。

1.4 引物设计根据参考文献[11]合成了8种不同毒力基因以及系统进化分群的引物(表2)。毒力基因包括与侵袭相关(IbeB)、铁摄取相关(IucD和IroN)、耶尔森菌强毒力岛(FyuA和Irp2)、免疫逃避相关(OmpA和OmpT)以及补体抗体蛋白(TraT)的相关基因。ibeB、iroN、fyuA、irp2、ompA、ompT和traT的引物参考文献[12-16]，根据NCBI 所获取的基因序列，使用 Primer Premier 5.0软件设计iucD的引物。引物由北京擎科生物技术有限公司合成。

表2 毒力基因引物信息

1.5 系统进化分群鉴定参考CLERMONT等[11]系统进化分群的方法将E.coli分为8个系统群。以提取的281株E.coli基因组DNA作为模板，用多重PCR进行特异性片段扩增，对扩增产物进行电泳、拍照，并依据CLERMONT等[10]所建立的方法进行系统群判定。

1.6 相关毒力基因的检测以提取的281株E.coli基因组DNA为模板，PCR反应进行毒力基因检测，其中fyuA和irp2采用双重PCR。PCR反应体系(20 μL)：Premix TaqTM10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板1.0 μL，加灭菌双蒸水至20 μL。扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，退火温度为55～64℃(根据引物的Tm值确定)，72℃延伸20～70 s(根据产物长度确定)，30个循环；72℃延伸5 min。以实验室保存的携带相应特异性基因的菌株作为阳性对照，灭菌超纯水为阴性对照。PCR产物由1.5%的琼脂糖凝胶检测，条件：120 V，30 min。电泳结束后使用全自动凝胶成像系统拍照并记录结果。

1.7 数据分析采用IBM SPSS Statistics 24进行卡方检验，分析不同时间和来源E.coli分离株系统进化群、毒力基因之间的相关性。

2 结果

2.1E.Coli分离株的系统群分布鉴定结果显示，281株E.coli被分为8个群，其中B1群占比最大，为51.96%(146/281);其次是A、E、F、D、C、B2群和隐支Ⅰ或Ⅱ，占比分别为28.47%(80/281),11.39%(32/281),2.85%(8/281)、1.78%(5/281)、1.07%(3/281),0.71%(2/281),0.36%(1/281)，有4株为未知系统群。不同牛场、样品来源和年份的菌株的系统群分布情况如表3所示。使用IBM SPSS Statistics 24进行卡方检验分析E.coli分离株的系统群与牛场、年份和养殖环境的相关性。结果显示χ2(系统群-年份)=16.193，P>0.05；χ2(系统群-牛场)=12.359，P>0.05；χ2(系统群-养殖环境)=14.797，P>0.05。说明本研究中不同年份、牛场和养殖环境的菌株的系统群分布无显著差异。

表3 不同样品来源E. coli的系统群分布

2.2 毒力基因在E.Coli分离株中的分布情况本试验对281株奶牛养殖场环境源E.coli分离株进行8种相关毒力基因的检测，8种毒力基因均被检测出(表4)。检测结果表明，ibeB和ompA是E.coli的保守基因，在检测菌株中阳性率超过90%；含有ompT、traT、iucD和iroN的菌株阳性率为64.1%～76.2%；而irp2和fyuA在分离菌株中检出率相对较低，阳性率为30%左右。值得注意的是，irp2和fyuA的共存率达96.55%，这2个基因是高致病性毒力岛的标志性基因。另外，毒力基因分布统计显示，所有的E.coli分离株至少同时含有2个毒力基因，同时含有3，4，5，6，7个毒力基因的菌株分别为31株(11.0%)、48株(17.1%)、72株(25.6%)、51株(18.1%)和24株(8.5%)。48株E.coli分离株同时含有8个毒力基因，占比为17.1%，并且呈现逐年递增的趋势。统计结果显示，这48株分离株在分群和养殖环境中的分布存在极显著性的差异，在B1和B2群的占比明显高于其他群，与粪土源呈正相关，表明B1、B2群和粪土源E.coli分离株携带的毒力基因较多，提示其致病性较强。

表4 不同样品来源E.coli的毒力基因分布

使用IBM SPSS Statistics 24进行卡方检验分析E.coli分离株8个毒力基因与牛场、年份和养殖环境的相关性。结果显示χ2(年份-iucD)=6.263，P<0.05；χ2(年份-traT)=16.538，P<0.001；χ2(养殖环境-traT)=9.348，P<0.01；χ2(养殖环境-iroN)=34.888，P<0.001。说明不同年份iucD的分布情况存在显著差异，traT的分布情况存在极显著性差异；不同养殖环境traT和iroN的分布存在极显著性差异。根据Cramer's V系数的值，可以判定年份、牛场和养殖环境与毒力基因的相关性强弱。Cramer's V(年份-iucD)=0.15；Cramer's V(年份-traT)=0.24；Cramer's V(养殖环境-traT)=0.18；Cramer's V(养殖环境-iroN)=0.35。表明年份与毒力基因traT和iucD存在弱相关性，养殖环境与traT存在弱相关性，与iroN存在中相关性。当Adjusted residual的绝对值大于3时，该数值的观测频数与期望频数之间的差异具有统计学意义。统计结果显示，2017年分离株与traT存在负相关性；粪土源分离株与traT和iroN存在正相关性，污水源分离株与traT和iroN存在负相关性。研究结果表明，不同年份和养殖环境的部分毒力基因的分布有着明显差异。

2.3 不同系统群中E.coli分离株毒力基因分布情况使用IBM SPSS Statistics 24进行卡方检验分析E.coli分离株的系统群与8个毒力基因的相关性。结果显示，χ2(ompT)=33.68，P<0.001；χ2(irp2)=30.66，P<0.001；χ2(fyuA)=31.97，P<0.001；χ2(iucD)=54.35，P<0.001；χ2(iroN)=23.22，P<0.01；χ2(traT)=19.67，P<0.05；χ2(ibeB)=1.46，P>0.05。说明ompT、irp2、fyuA、iucD和iroN在不同系统群之间的分布情况存在极显著性差异，traT在不同系统群之间的分布情况，存在显著性差异，ibeB和opmA在不同系统群之间的分布无差异。Cramer's V(traT)=0.27；Cramer's V(iroN)=0.29；Cramer's V(irp2)=0.33；Cramer's V(fyuA)=0.34；Cramer's V(ompT)=0.35；Cramer's V(iucD)=0.44。表明系统群与毒力基因traT和iroN存在弱相关性，与ompT、irp2、fyuA和iucD存在中相关性。Adjusted residual的值表明，A群与ompT和traT存在负相关性；B1群与ompT、irp2、fyuA和iucD存在正相关性；E群与irp2、fyuA和iucD存在负相关性，与iroN存在正相关性。研究结果表明，系统群与部分毒力基因的分布存在明显关联(表5)。

表5 不同系统群中E.coli分离株毒力基因的分布

3 讨论

E.coli属于人类和多宿主动物的正常肠道微生物区系，在环境中分布广泛，可通过饮水、食物以及密切接触等途径传播[17]。E.coli是一种机会性致病菌，粪便是E.coli的“储存库”[18]，可向外界散播病原菌，污染饮水、饲草和农作物[19]，对人畜健康构成潜在威胁。其特征是毒力基因高度多样性，是引起人类、牲畜、野生动物和伴侣动物肠道和肠外症状的主要病原体[3,20]。故本试验以养殖场环境E.coli为研究对象，对其进行分子流行病学调查，以掌握其流行特征及规律，为精准防治提供依据。

大量研究表明E.coli致病性与系统进化分群有关[17]。肠外致病性E.Coli大都为B2和D群，而 A和B1群多为共生性和肠内致病菌。说明A和B1群菌株的致病性较弱，为条件性致病菌，而B2和D群菌株的致病性较强[9]。分离自乳腺炎奶牛[21]、猪源肠外致病性E.coli[22](extraintestinal pathogenicE.coli，ExPEC)、奶牛子宫内膜炎[23]、腹泻患者和牛羊[24]、腹泻牦牛源[25]和不同健康状况骆驼源[26]的E.coli大多数属于A和B1群，这与本研究的结果是一致的。但本研究中发现，携带8个毒力基因的菌株在B1和B2群中的分布明显高于其他分群，且B1群与irp2和fyuA等强致病性毒力因子存在正相关，其原因有待进一步研究。在人源[27]、犬猫源[28]、禽源[29]ExPEC中B2群和D群的占比较大，B2群和D群在本研究中所占比例较小，可能的原因是不同来源的E.coli所属系统进化群存在差异，除此之外目前多数研究者采用三重PCR鉴定系统进化分群，B2群和D群是被高估的系统群。KAWAMURA等[30]研究结果显示，B2群的致病性E.coli携带毒力基因较其他群多，本研究中的2株B2群的菌株携带8个已鉴定的毒力基因。

E.coli致病性的强弱与毒力基因的表达联系密切，E.coli毒力基因种类繁多，并不断发现新的毒力基因。OmpA是由ompA编码的ExPEC重要的结构性蛋白[31]，在一些ExPEC感染病例中，OmpA可增强菌株的抗血清能力和生存能力[32]。由ibeB编码的侵袭素IbeB是E.coli中重要的致病因子[33]，在人源高致病性B2群ExPEC的报道较多。本研究中ompA的检出率为100%，ibeB的检出率也达到98.6%，这与从病禽分离出的禽致病性大肠埃希菌(avian pathogenicE.coli，APEC)菌株和病猪源ExPEC的结果相吻合[34-35]。本研究中ibeB阳性检出率为98.6%，明显高于相关报道的3.1%(2/64)[36]、5.8%(3/52株)[37]和44.4%(140/315株)[22]的检出率，这可能是因为菌株对宿主的适应性不同[22]。fyuA和irp2是检测HPI的标志性基因[8]。我国西部某医院分离的腹泻性E.coli中fyuA、irp2基因携带率为100%[14]；鸵鸟源E.coli菌株中irp2基因在致病性E.coli中的检出率明显高于共生型E.coli[38]；病源毛皮动物脾脏、肝脏等实质性器官[39]的E.coli中fyuA、irp2的检出率为85.7%。上述研究结果表明，从患病源所分离E.coli的fyuA和irp2基因检出率较高。本研究中的irp2和fyuA基因检出率均低于上述报道，可能是因为本研究样品来源不针对病源。目前已有研究利用基因敲除技术构建iucD基因缺失株，并通过动物试验证实iucD基因缺失能降低E.coli的致病性，从而证明iucD基因和E.coli的致病性之间有一定的相关性[40-41]。EWERS等[42]研究发现病禽中iucD的检出率明显高于健康禽，李巧玲[43]报道显示狐源E.coli中iucD基因的检出率为71.4%，贾青辉等[44]报道鸡源致病性E.coli中iucD基因的检出率为95.2%，而在本研究中iucD基因的检出率为64.1%，提示本养殖环境中存在致病性较强的菌株，应加强养殖场粪便管理，减少粪便向人或其他动物传播的可能性。在SUBEDI等[45]的研究中，APEC分离株中ompT和iroN的检出率为100%，CARLI等[46]报道的APEC菌株中ompT和iroN的检出率分别为100.0%和98.8%。本研究中ompT和iroN的检出率分别为76.2%和71.5%，均低于上述报道。ASAI等[47]发现这5种毒力基因(iutA、hlyF、iss、iroN和ompT)与APEC的高致病力相关，而本研究中的E.coli并未确定为APEC，这可能是本研究中ompT和iroN的检出率较低的原因。E.coli的traT基因编码的外膜蛋白与补体系统相互作用，被认为是血清抗性因子[48]。从临床乳房炎奶牛中分离的E.coli中traT基因的流行率为24.6%～83.3%[49-50]。traT基因与引起肠道外疾病存在紧密的联系，在本研究中traT基因的检出率也较高(68.3%)，而且2018和2019年的traT基因的检出率较2017年高，这需要引起高度重视。此外，本研究显示，粪土与traT和iroN呈正相关，污水与traT和iroN呈负相关，说明经过无害化处理之后，能够降低致病性E.coli的数量。粪土中traT和iroN毒力基因的高检出率提示要做好养殖场内粪便的管理，减少粪便向外界传播致病性E.coli的机会，减少在人畜之间及其他动物之间传播的可能性，同时经过无害化处理之后的污水中毒力基因的检出率降低，证实该牛场采取的无害化处理是有效的。