猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备及免疫原性评价

赵 强，赵云环，郭 禹，翟 刚，张 帅，郭晓旭，范京惠，左玉柱*

(1.河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071001；2.河北省兽医生物技术创新中心，河北 保定 071001)

猪圆环病毒病(porcine circovirus associated diease,PCVAD)是由猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)感染导致的，患病猪可呈现多系统衰竭综合征、皮炎肾病综合征、呼吸综合征、母猪繁殖障碍、仔猪断奶后多系统衰竭等症状，该病毒会破坏机体的免疫机能，造成免疫应答能力减弱，进而导致机体易受其他病原体的侵袭[1]。此外，该病分布广泛，存在于所有主要猪肉生产国，给世界养猪业造成了巨大的经济损失[2]。

猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2编码的衣壳蛋白(Cap)是病毒的唯一结构蛋白，决定病毒的抗原性，在一定情况下可自发组装成17 nm左右的病毒样颗粒(VLP)[3]。VLP不含病毒遗传物质，不能复制，不具有感染能力，具有天然病毒颗粒的类似空间立体结构，可以有效地诱导机体产生免疫保护效应[4]。因此，Cap已成为许多研究人员体外表达并研制成亚单位疫苗的理想目标。

现有市场上暂无针对PCV2的特效药，接种疫苗是控制PCV2感染的一种有效而经济的方法[5]。目前，国内市场上多为灭活疫苗和亚单位疫苗。灭活疫苗通常在PK-15细胞中生产，但是PCV2在PK-15细胞中繁殖不良，产量较低[6]。亚单位疫苗中基于衣壳蛋白的VLP疫苗可以在真核表达系统或原核表达系统中生产并独立自组装形成VLPs，但在真核表达系统中，生产周期长，需要昂贵的超速离心或层析提纯，试验条件要求高。在原核表达系统中制备VLP疫苗则成本低，生产周期短，但由于Cap蛋白N端富含连续的稀有密码子，使其在大肠杆菌中难以表达[7]。因此，为实现在大肠杆菌中PCV2 Cap蛋白全长的可溶性表达，并通过镍亲和层析法纯化，使其在体外组装成VLP，本研究尝试将临床分离得到的PCV2 ORF2全长密码子优化，并转入表达菌株BL21中诱导表达，尝试用改良的镍亲和层析法纯化Cap蛋白并通过透析组装VLP，在小鼠体内初步评价了自制的VLP疫苗的免疫原性，为研制PCV2亚单位疫苗及相关生物制品奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料pET32a载体、T4DNA连接酶、pMD19-T 载体、DL5000/DL2000 DNA Marker、限制性核酸内切酶HindⅢ、BamHⅠ、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒，均购自宝生物工程(大连)有限公司；PCV2 IgG抗体定性检测试剂盒(ELISA)购自江苏博深生物科技有限公司；6～8周龄SPF BALB/c小鼠购自北京斯贝福公司；Blue Plus Protein Marker购自北京全式金生物技术有限公司；PCV2灭活疫苗(ZJ/C株)购自瑞普生物；His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)购自Cwbio Beijing公司；氨苄青霉素钠、DAB显色试剂盒、NC膜等购自Solarbio Beijing公司；HRP标记的6*His，His-Tag小鼠单克隆抗体、HRP标记兔抗猪IgG抗体购自 Proteintech Beijing公司;猪源PCV2 Cap多克隆抗体、E.coliDH5α、BL21感受态细胞由河北农业大学动物传染病实验室冻存。

1.2 目的基因的获得与重组表达质粒的鉴定根据PCV2(GenBank：KX641138.1)ORF2序列，设计特异性引物PCV2-Cap-F：5′-ATGACGTATCCAAGGAGGCG-3′和PCV2-Cap-R：5′-TTAGGG-TTTAAGTGGGGGGT-3′。以临床组织病料中提取的DNA为模板，进行PCR扩增，随后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段，送往上海生工生物有限公司进行测序。测序后得到的目的基因利用密码子适配工具(http://www.friendbio.com/codon.html)将密码子优化至CAI=1，并交由上海生工生物有限公司合成重组质粒pET-32a-yCap(含酶切位点BamHⅠ和HindⅢ)，优化前后的序列详见图1。将重组质粒pET-32a-yCap进行双酶切鉴定，鉴定正确后，胶回收优化后的目的基因进一步测序鉴定，鉴定成功的重组质粒备用。

1.3 重组菌的诱导表达及可溶性分析将鉴定正确的重组质粒转化到BL21感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基中37℃过夜培养；次日挑取单个菌落于含5 μL氨苄青霉素的5 mL LB液体培养基中，37℃，200 r/min培养14 h。以此菌液为母液，在含100 μL氨苄青霉素的100 mL LB液体培养基中加入1 mL母液，37℃，200 r/min 培养至D600值为0.6左右时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，继续培养4 h。随后在4℃情况下10 000 r/min离心10 min，收集诱导表达后的菌体沉淀。按每100 mg湿菌体加入3 mL菌体裂解液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，10%甘油，0.1%吐温80，10 mmol/L β-巯基还原剂)进行重悬，在冰浴中进行超声破碎菌体。待菌体充分裂解后，在4℃情况下10 000 r/min离心3 min，分别收集上清与沉淀，沉淀用等量上清液的PBS进行重悬。上清与重悬后的沉淀各取40 μL并加入10 μL 5×SDS上样缓冲液，105℃变性5 min，用于后续SDS-PAGE分析蛋白的表达与表达方式。

1.4 镍亲和层析法纯化Cap蛋白收集超声裂解后的蛋白，10 000 r/min 4℃离心3 min，收集上清中的可溶性蛋白。以平衡液(50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，5%甘油，0.05%Tween 80)平衡Ni-NTA亲和层析柱，将可溶性蛋白以0.3 mL/min流速，通过重力作用与Ni-NTA亲和层析柱填料充分结合；再以洗涤液(20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，5%甘油，0.05%Tween 80)彻底洗脱与Ni-NTA亲和层析柱结合弱的杂蛋白；最后，以洗脱液(20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，5%甘油，0.05%Tween 80)对目的蛋白进行洗脱，洗脱后利用透析的方式将β-巯基还原剂除去。样品置于-20℃保存备用。

1.5 可溶性蛋白Cap的 Western blot分析取纯化后的蛋白上清进行SDS-PAGE电泳，分别命名为His-Cap和PCV2多抗-Cap。将电泳结束后的蛋白胶在半干转膜仪上，23 V，30 min转印至2张NC膜上，NC膜在4℃情况下用5%脱脂奶粉过夜封闭；封闭结束后分别以1∶1 000和1∶5 000的比例在含5%脱脂奶粉的PBST中加入PCV2多克隆抗体和HRP标记的6*His，His-Tag小鼠单克隆抗体，室温摇床孵育1 h；孵育完毕用PBST洗膜5次，每次4 min;用洁净的滤纸将His-Cap膜表面多余水分吸收，用DAB显色试剂避光显色2 min后，用蒸馏水冲洗，终止反应，观察结果。PCV2多抗-Cap用含5%脱脂奶粉的PBST按1∶5 000的比例稀释HRP标记兔抗猪IgG抗体，室温摇床孵育1 h；PBST洗膜5次，每次5 min，随后进行显色，观察结果。

1.6 可溶性蛋白Cap VLP的透射电镜观察透射电镜型号为JEM-1400，取经镍亲和层析法纯化后的蛋白悬液10 μL滴到铜网上，静置10 min后，然后用滤纸的毛边吸去多余的液体，滴上10 μL磷钨酸负染色液，静置2 min，用滤纸吸去负染色液，自然干燥后用于电镜观察。

1.7 疫苗的制备将形成VLP的蛋白悬液质量浓度调整为0.5 g/L后，取100 μL VLP与100 μL弗氏佐剂等体积混匀，乳化。一免选用弗氏完全佐剂，二免选用弗氏不完全佐剂。配置好的疫苗置于4℃备用。

1.8 VLP免疫小鼠后抗体水平的测定将18只BALB/c小鼠随机分为3组，每组6只。第1组为VLP组，第2组为PCV2灭活疫苗(ZJ/C株)，第3组为佐剂对照组。免疫方式为皮下多点注射，各组剂量为200 μL/只，VLP组含抗原50 μg，首次免疫后第2周加强免疫。免疫后第2周开始每7 d尾部采血1次，直至第42天，及时分离血清，避免反复冻融，用于抗体的检测。

2 结果

2.1 PCV2 ORF2基因与重组表达质粒鉴定以临床仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)发病猪中提取的DNA为模板，PCR扩增出的基因片段大小为702 bp(图1)，经过测序比对证实获得的基因为PCV2 ORF2基因，随后将目的基因进行密码子优化并交由生工生物(上海)有限公司进行质粒合成，不含终止密码子，具体序列见图2。

将合成的质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，在700 bp左右处有1条明显的条带，符合理论大小(图1)。将双酶切鉴定正确的质粒送至生工生物(上海)有限公司测序，结果与密码子优化后的序列完全相符。

M1.DL2000 DNA Marker；1.PCV2 ORF2基因(含终止密码子)；2.阴性对照；M2.DL5000 DNA Marker;3.pET-32a-yCap BamHⅠ/HindⅢ酶切；4.pET-32a空载体BamHⅠ/HindⅢ酶切

2.2 重组菌的诱导表达及可溶性分析将经IPTG诱导后的重组菌体与诱导前作对比，经SDS-PAGE电泳分析如图3所示，诱导后的重组菌pET-32a-Capb在47 kDa左右有明显的条带，与预期大小相符，证明成功表达了Cap蛋白。收集诱导表达后的菌体沉淀，重悬沉淀后超声裂解，分别对上清和沉淀进行分析，结果如图4所示，绝大部分蛋白以可溶性方式存在，只有少许蛋白存在于包涵体中。

M.蛋白Marker(14～100 kDa);1.诱导后pET-32a载体蛋白；2.重组蛋白诱导前；3.重组蛋白诱导后；4.重组蛋白超声沉淀；5.重组蛋白超声上清

M.蛋白Marker(14～100 kDa);1.上样流穿液；2～12.纯化的Cap蛋白

2.3 镍亲和层法纯化Cap蛋白重组菌表达的可溶性蛋白经镍亲和层析纯化后，得到了纯度高、单一的目的蛋白。

2.4 可溶性蛋白Cap的Western blot分析将纯化后的蛋白进行Western blot鉴定。一抗为猪源多克隆抗体、二抗为HRP标记的兔抗猪IgG抗体；抗体为HRP标记的6*His，His-Tag小鼠单克隆抗体。结果如图5所示，在47 kDa处有1条明显的特异性条带，与预期大小符合。

1.一抗“猪源多克隆抗体”;2.二抗HRP标记免抗猪IgG抗体；3.HRP标记6*His;4.His-Tag小鼠单克隆抗体;M.蛋白Marker(14～100 kDa)

2.5 可溶性蛋白Cap VLP病毒样颗粒的透射电镜观察取10 μL经过磷钨酸负染色后的蛋白悬液，在透射电镜下放大20 000倍，可观察到大小均一、形态规则，直径在20 nm左右的病毒样颗粒，与天然的猪圆环病毒粒子极为相似。由图6可知，本研究中所制备的Cap蛋白能够自发的组装成VLP且形态结构良好。

图6 Cap蛋白自组装成VLP的透射电镜观察(200 000×)

2.6 免疫后小鼠PCV2 IgG抗体水平的测定ELISA结果显示，两组疫苗在免疫后14 d时抗体均已达到临界值且VLP组显著高于灭活疫苗组(P<0.01)，免疫后42 d，VLP组抗体水平显著高于灭活疫苗组(P<0.01)且仍维持在一个较高水平，VLP组诱导产生的抗体水平高于灭活疫苗组。为进一步验证VLP刺激小鼠所产生的免疫反应类型和水平，本研究测定了免疫后14，28 d时，Th1型细胞因子IFN-γ,TNF-α和Th2型细胞因子IL-4的含量。结果显示，在免疫后14，28 d时，VLP组所产生的细胞因子水平均高于灭活疫苗组，具有显著差异性(P<0.01)(图7)。

图7 免疫小鼠后PCV2 IgG抗体及细胞因子水平的测定

3 讨论

PCV2分布广泛，呈世界性流行，猪场一旦发生PCVAD，就会造成无法挽回的经济损失，接种疫苗是防控此病的重要措施[8]。VLP疫苗模仿了天然病毒粒子的整体结构，但不含有病毒的基因组结构；在抗原性上，保留了天然的抗原构象，与其来源的病毒难以区分；在安全性上，它是绝对非传染性和不可复制的，具有重要的优势;VLP能激发机体强烈的细胞免疫与体液免疫，适合作为同源病毒的疫苗[9]。

已有研究发现，PCV2 Cap蛋白可在大肠杆菌中组装形成VLP，但需要将N端的核定位信号区进行密码子优化或截短[10]。密码子优化可以显著提高蛋白的表达水平，但过度优化可能会导致表达速度过快，表达产物不能正确折叠和修饰而以无活性的包涵体形式表达，增加蛋白纯化的难度。此外，由于PCV2衣壳蛋白可在体外自发组装成VLP的特性，致使N端的His-Tag标签折叠到VLP内部，常规的镍亲和层析纯化法无法将其进行纯化[11]。虽然已有学者利用离子层析、凝胶过滤层析、CsCl密度梯度离心或多种方法相结合的方式纯化PCV2 VLP，但提高了蛋白纯化的成本，不适用兽用疫苗的生产[12]。因此，本研究尝试将PCV2 ORF2完整的基因进行密码子全优化，并在纯化过程中添加β-巯基还原剂，以期探索出一种制备PCV2 VLP的简易方法。

本研究成功从临床样本中分离扩增出PCV2 ORF2序列并将其全长进行密码子优化，获得重组质粒pET-32a-yCap，在大肠杆菌表达菌株BL21中实现了Cap蛋白的可溶性表达，并通过改良镍亲和层析法将目的蛋白成功纯化，表明密码子全优化是一种制备PCV2 VLP的可行策略，β-巯基还原剂可成功抑制VLP的组装。经SDS-PAGE与Western blot鉴定，重组蛋白带有His-Tag标签并具有良好的反应原性，能与PCV2多克隆抗体和HRP标记的6*His，His-Tag小鼠单克隆抗体发生特异性结合。重组蛋白经透射电镜观察，能在体外成功自发组装成直径17～20 nm的VLP。小鼠免疫试验显示，重组Cap蛋白所组装的VLP诱导产生的抗体水平强于PCV2灭活疫苗(ZJ/C株)。为研制出成本低廉、安全有效、效果稳定的PCV2亚单位疫苗奠定了基础。