万州区猕猴桃溃疡病的防治药剂室内筛选

刘兰泉，王东（等）

摘要：为筛选出针对防治万州区猕猴桃（Actinidia chinensis）溃疡病菌的高效药剂，将初筛出的10种常见商品杀菌剂分别采用纸碟法和平板划线法进行室内抑菌试验，进一步筛选出6种抑菌效果较好的药剂进行室内毒力测定。结果表明，乙蒜氯霉的抑菌效果最好，EC50为36.34 mg/L；其次是新田秀才6号、农用硫酸链霉素，其EC50分别为83.21、92.34 mg/L。

关键词：猕猴桃（Actinidia chinensis）；溃疡病；杀菌剂；毒力

中图分类号：S482.2；S663.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1560-03

Indoor Screening of Bactericides against Kiwifruit Canker in Wanzhou Distict

LIU Lan-quan，WANG Dong，LIU Lu，QIN Gui-yong，WU Qiong

（Department of Agriculture and Forestry Science and Technology，Chongqing Three Gorges Polytechnic College，

Chongqing 404155，China）

Abstract： In order to screen the highly efficient medicines against the Kiwifruit canker in Wanzhou district， 10 preliminarily screened common medicines were used for indoor antibacterial tests with paper plates and plate streaking method. 6 kinds of medicine with relatively better antibacterial effect were selected for indoor virulence test. The results showed that Chloramphenicol B. garlic had the best antibacterial effects with the EC50 of 36.34 mg/L， followed by the New Tianxiucai No.6 and agricultural streptomycin sulphate ranking the second and third with the EC50 of 83.21 mg/L and 92.34 mg/L， respectively.

Key words： Actinidia chinensis； canker； bactericide； toxicity

猕猴桃溃疡病是猕猴桃（Actinidia chinensis）生产上的重要病害之一，主要危害主干枝条、花及叶片，可引起枝干溃疡或枝叶萎蔫死亡，可致叶片产生暗褐色不规则病斑[1]。猕猴桃溃疡病于1980年在美国加利福尼亚州和日本神州静冈县发现，中国最早于1986年在湖南省东山峰农场发现[2]，随后安徽、四川、福建、陕西等省相继报道此病的发生，并将该病列为全国森林植物检疫对象[3-5]。目前万州区大面积栽种猕猴桃，生产过程中溃疡病发生严重，个别果园甚至面临毁园的局面，给万州区猕猴桃生产带来巨大威胁。虽然国内外关于此病的报道较多，但由于各地理区域气候等条件不尽相同，不能照搬套用其防治技术。为做好万州区猕猴桃溃疡病的防治工作，本研究初步进行了防治药剂的室内筛选，以期为万州区猕猴桃溃疡病的防治提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：供试猕猴桃溃疡病菌株分离自万州区猕猴桃溃疡病重发区病部样品。

供试药剂：81%乙蒜氯霉EC（天津汉邦植物保护剂有限公司）、新田秀才6号EC（上海新田秀才生物科技有限公司）、72%农用硫酸链霉素PX（成都普惠生物工程有限公司）、3 000亿/g荧光假单胞杆菌DP（江苏省常州兰陵制药有限公司）、6%春雷霉素WP（汤普森生物科技有限公司）、3%中生菌素WP（福建凯立生物制品有限公司）、53.8%铜制剂WDG（郑州志信农化有限公司）、77%硫酸铜钙WP（西班牙艾克威化学工业有限公司）、40%甲霜灵WP（福建新农大正生物工程有限公司）、20%叶枯唑EC（东莞市瑞德丰生物科技有限公司）。

供试培养基（NA培养基）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂18.0 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，pH 6.8～7.0，培养基121～126 ℃湿热灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1 猕猴桃溃疡病菌分离纯化 用消毒后的解剖刀将发病猕猴桃枝条溃疡处表面皮层轻轻刮去，剥下小块内部褐色组织于75%乙醇中浸泡10 s，再放入0.1%氯化汞溶液中消毒40 s后取出，转放入无菌水中漂洗3次。洗净后将组织块放入无菌培养皿中，滴入2滴无菌水，用无菌玻棒捣碎，静置5 min，用玻棒蘸取菌液在NA培养基上划线，28 ℃培养48 h。待长出菌落后，挑取圆形、稍隆起、黄白色稀汤状、有光泽的菌落于NA培养基上纯化3次，再挑取单一菌落置于NA斜面中，于室温中保存。

1.2.2 菌悬液的配制 活化供试菌于28 ℃培养48 h后，用无菌水配制成病菌原液，取1 mL原液用无菌水按10、100、1 000倍稀释后涂于NA培养基平板上，28 ℃培养48 h，根据平板上长出的菌落数推算出病菌原液浓度。选择1 mL菌悬液涂板后长出的菌落数为100个左右的浓度，并按此制备出菌悬液。

1.2.3 室内抑菌试验 室内抑菌试验分别采用纸碟法和平板划线法进行测定[6，7]。

1）纸碟法。将配制好的菌悬液与NA培养基（约45 ℃）以V/V=1∶9的比例混合，制成混菌培养基后迅速倒入无菌培养皿。将各供试药剂用无菌水分别稀释成100、200、400倍的药液，将直径为5 mm的圆形无菌滤纸片放入不同浓度的药液中充分浸湿，置于混菌培养基平板中心，每皿放置1片纸碟，每种浓度设3次重复，以浸湿无菌水的纸碟作为对照。28 ℃培养24 h后测量抑菌圈大小。

2）平板划线法。分别配制稀释400、800、1 600倍的各供试药剂NA培养基，每种浓度设置3个平板（分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），以不含药的NA平板培养基作为对照。将已活化的供试菌在各平板上划“井”字。28 ℃培养24 h后观察菌落生长情况。

1.2.4 药剂室内毒力测定 经过室内抑菌试验，筛选出抑菌效果较好的药剂进一步进行室内毒力测定。按室内抑菌试验的纸碟法，配置好带菌培养基。在预试验基础上，将各供试药剂配置成相应浓度梯度的药液，将直径为5 mm的圆形无菌滤纸片放入不同浓度的药液中充分浸湿，置于混菌培养基平板中心，每种浓度设3次重复，以浸湿无菌水的纸碟作为对照（CK）。28 ℃培养24 h后，测量抑菌带宽度。所得结果用农药室内生物测定数据处理系统软件计算，得出各药剂的毒力回归方程式和EC50。

抑菌率=[（处理皿中抑菌带宽-对照皿中抑菌带宽）/（对照皿中菌落覆盖圈半径-纸碟半径）]×100%

2 结果与分析

2.1 药剂室内抑菌试验结果

室内抑菌试验结果中，无论是采用纸碟法还是平板划线法，各供试药剂对猕猴桃溃疡病原菌的抑制作用差异均较大（表1、表2）。其中乙蒜氯霉效果最好，纸碟法试验中3种稀释倍数条件下所产生的抑菌圈均大于等于2.2 cm；其次为新田秀才6号及农用硫酸链霉素，100倍稀释条件下产生的抑菌圈均为1.8 cm；春雷霉素、铜制剂、荧光假单胞杆菌、硫酸铜钙的抑菌效果较差。平板划线法试验中，乙蒜氯霉效果最好，所有浓度均无生长；其次为新田秀才6号、农用硫酸链霉素、中生菌素及叶枯唑，仅1 600倍稀释药液的处理中有零星病菌生长。

2.2 药剂室内毒力测定结果

经过室内抑菌试验后，筛选出对猕猴桃溃疡病菌抑制效果较好的6种药剂，分别进行室内毒力测定，所得EC50的大小是衡量药剂毒力大小的重要指标，EC50越小表明药剂的毒力越强。各试验药剂的抑菌效果差异明显（表3），乙蒜氯霉对猕猴桃溃疡病菌的抑制效果最好，EC50为36.34 mg/L；其次为新田秀才5号和农用硫酸链霉素，EC50分别为83.21 mg/L和92.34 mg/L。铜制剂、荧光假单胞杆菌和硫酸铜钙的效果较差，EC50均超过1 000 mg/L。

3 小结与讨论

猕猴桃溃疡病是一种毁灭性病害，该病在万州发生日益严重，目前尚没有一种方法能够有效控制，该病如不及时防治，易在短时期内暴发成灾。目前化学药剂防治仍是猕猴桃溃疡病的重要防治措施，尽管其存在抗药性及环境污染等方面的问题，但从目前的发展情况来看，化学防治仍占主导地位。本研究通过对多种常见杀菌剂进行室内抑菌试验及室内毒力测定，以期能找到有效防治万州猕猴桃溃疡病菌的针对性药剂。

杀菌剂的防治可分为化学保护、化学治疗和化学免疫。杀菌剂毒力测定通常是在特定条件下进行，其结果可作为评估药剂效果的一个重要参考值[8]。本试验筛选出了乙蒜氯霉、新田秀才6号及农用硫酸链霉素，证明这3种药剂对万州猕猴桃溃疡病菌的抑制作用均较好，其中以乙蒜氯霉的效果最佳。在生产中，可选用这3种药剂直接对猕猴桃溃疡病进行施药，但在实际施药过程中，还应考虑施药时间、田间气候条件等因素。为延缓植物抗药性的产生，建议应将此3种药剂交替使用。

参考文献：

[1] 黄宏文.猕猴桃研究进展[M].北京：科学出版社，2000.

[2] 雷 庆.猕猴桃溃疡病的病原分类、噬菌体及发生规律研究[D].四川雅安：四川农业大学，2007.

[3] 王振荣，钱子华.猕猴桃溃疡病主要发病条件研究[J].安徽农业科学，1998，26（4）：347-348.

[4] 刘绍基，王忠肃，唐显富，等.四川省苍溪猕猴桃溃疡病的发生规律[J].中国果树，1996（1）：25-26.

[5] 宋晓斌，王培新，张星耀，等.陕西猕猴桃病虫害发生与危害的调查分析[J].西北林学院学报，1998，13（3）：79-84.

[6] 张 锋，陈志杰，张淑莲，等.猕猴桃溃疡病药剂防治技术研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2005，33（3）：71-75.

[7] 严 杰，罗海波，陆德源.现代微生物学实验技术及其应用[M].北京：人民卫生出版社，1997.

[8] 姚廷山，周常勇，胡军华，等.3种杀菌剂对柑橘溃疡病菌的室内毒力测定[J].江西农业大学学报，2009，31（6）：1026-1029.

1.2.3 室内抑菌试验 室内抑菌试验分别采用纸碟法和平板划线法进行测定[6，7]。

1）纸碟法。将配制好的菌悬液与NA培养基（约45 ℃）以V/V=1∶9的比例混合，制成混菌培养基后迅速倒入无菌培养皿。将各供试药剂用无菌水分别稀释成100、200、400倍的药液，将直径为5 mm的圆形无菌滤纸片放入不同浓度的药液中充分浸湿，置于混菌培养基平板中心，每皿放置1片纸碟，每种浓度设3次重复，以浸湿无菌水的纸碟作为对照。28 ℃培养24 h后测量抑菌圈大小。

2）平板划线法。分别配制稀释400、800、1 600倍的各供试药剂NA培养基，每种浓度设置3个平板（分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），以不含药的NA平板培养基作为对照。将已活化的供试菌在各平板上划“井”字。28 ℃培养24 h后观察菌落生长情况。

1.2.4 药剂室内毒力测定 经过室内抑菌试验，筛选出抑菌效果较好的药剂进一步进行室内毒力测定。按室内抑菌试验的纸碟法，配置好带菌培养基。在预试验基础上，将各供试药剂配置成相应浓度梯度的药液，将直径为5 mm的圆形无菌滤纸片放入不同浓度的药液中充分浸湿，置于混菌培养基平板中心，每种浓度设3次重复，以浸湿无菌水的纸碟作为对照（CK）。28 ℃培养24 h后，测量抑菌带宽度。所得结果用农药室内生物测定数据处理系统软件计算，得出各药剂的毒力回归方程式和EC50。

抑菌率=[（处理皿中抑菌带宽-对照皿中抑菌带宽）/（对照皿中菌落覆盖圈半径-纸碟半径）]×100%

2 结果与分析

2.1 药剂室内抑菌试验结果

室内抑菌试验结果中，无论是采用纸碟法还是平板划线法，各供试药剂对猕猴桃溃疡病原菌的抑制作用差异均较大（表1、表2）。其中乙蒜氯霉效果最好，纸碟法试验中3种稀释倍数条件下所产生的抑菌圈均大于等于2.2 cm；其次为新田秀才6号及农用硫酸链霉素，100倍稀释条件下产生的抑菌圈均为1.8 cm；春雷霉素、铜制剂、荧光假单胞杆菌、硫酸铜钙的抑菌效果较差。平板划线法试验中，乙蒜氯霉效果最好，所有浓度均无生长；其次为新田秀才6号、农用硫酸链霉素、中生菌素及叶枯唑，仅1 600倍稀释药液的处理中有零星病菌生长。

2.2 药剂室内毒力测定结果

经过室内抑菌试验后，筛选出对猕猴桃溃疡病菌抑制效果较好的6种药剂，分别进行室内毒力测定，所得EC50的大小是衡量药剂毒力大小的重要指标，EC50越小表明药剂的毒力越强。各试验药剂的抑菌效果差异明显（表3），乙蒜氯霉对猕猴桃溃疡病菌的抑制效果最好，EC50为36.34 mg/L；其次为新田秀才5号和农用硫酸链霉素，EC50分别为83.21 mg/L和92.34 mg/L。铜制剂、荧光假单胞杆菌和硫酸铜钙的效果较差，EC50均超过1 000 mg/L。

3 小结与讨论

猕猴桃溃疡病是一种毁灭性病害，该病在万州发生日益严重，目前尚没有一种方法能够有效控制，该病如不及时防治，易在短时期内暴发成灾。目前化学药剂防治仍是猕猴桃溃疡病的重要防治措施，尽管其存在抗药性及环境污染等方面的问题，但从目前的发展情况来看，化学防治仍占主导地位。本研究通过对多种常见杀菌剂进行室内抑菌试验及室内毒力测定，以期能找到有效防治万州猕猴桃溃疡病菌的针对性药剂。

杀菌剂的防治可分为化学保护、化学治疗和化学免疫。杀菌剂毒力测定通常是在特定条件下进行，其结果可作为评估药剂效果的一个重要参考值[8]。本试验筛选出了乙蒜氯霉、新田秀才6号及农用硫酸链霉素，证明这3种药剂对万州猕猴桃溃疡病菌的抑制作用均较好，其中以乙蒜氯霉的效果最佳。在生产中，可选用这3种药剂直接对猕猴桃溃疡病进行施药，但在实际施药过程中，还应考虑施药时间、田间气候条件等因素。为延缓植物抗药性的产生，建议应将此3种药剂交替使用。

参考文献：

[1] 黄宏文.猕猴桃研究进展[M].北京：科学出版社，2000.

[2] 雷 庆.猕猴桃溃疡病的病原分类、噬菌体及发生规律研究[D].四川雅安：四川农业大学，2007.

[3] 王振荣，钱子华.猕猴桃溃疡病主要发病条件研究[J].安徽农业科学，1998，26（4）：347-348.

[4] 刘绍基，王忠肃，唐显富，等.四川省苍溪猕猴桃溃疡病的发生规律[J].中国果树，1996（1）：25-26.

[5] 宋晓斌，王培新，张星耀，等.陕西猕猴桃病虫害发生与危害的调查分析[J].西北林学院学报，1998，13（3）：79-84.

[6] 张 锋，陈志杰，张淑莲，等.猕猴桃溃疡病药剂防治技术研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2005，33（3）：71-75.

[7] 严 杰，罗海波，陆德源.现代微生物学实验技术及其应用[M].北京：人民卫生出版社，1997.

[8] 姚廷山，周常勇，胡军华，等.3种杀菌剂对柑橘溃疡病菌的室内毒力测定[J].江西农业大学学报，2009，31（6）：1026-1029.

1.2.3 室内抑菌试验 室内抑菌试验分别采用纸碟法和平板划线法进行测定[6，7]。

1）纸碟法。将配制好的菌悬液与NA培养基（约45 ℃）以V/V=1∶9的比例混合，制成混菌培养基后迅速倒入无菌培养皿。将各供试药剂用无菌水分别稀释成100、200、400倍的药液，将直径为5 mm的圆形无菌滤纸片放入不同浓度的药液中充分浸湿，置于混菌培养基平板中心，每皿放置1片纸碟，每种浓度设3次重复，以浸湿无菌水的纸碟作为对照。28 ℃培养24 h后测量抑菌圈大小。

2）平板划线法。分别配制稀释400、800、1 600倍的各供试药剂NA培养基，每种浓度设置3个平板（分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），以不含药的NA平板培养基作为对照。将已活化的供试菌在各平板上划“井”字。28 ℃培养24 h后观察菌落生长情况。

1.2.4 药剂室内毒力测定 经过室内抑菌试验，筛选出抑菌效果较好的药剂进一步进行室内毒力测定。按室内抑菌试验的纸碟法，配置好带菌培养基。在预试验基础上，将各供试药剂配置成相应浓度梯度的药液，将直径为5 mm的圆形无菌滤纸片放入不同浓度的药液中充分浸湿，置于混菌培养基平板中心，每种浓度设3次重复，以浸湿无菌水的纸碟作为对照（CK）。28 ℃培养24 h后，测量抑菌带宽度。所得结果用农药室内生物测定数据处理系统软件计算，得出各药剂的毒力回归方程式和EC50。

抑菌率=[（处理皿中抑菌带宽-对照皿中抑菌带宽）/（对照皿中菌落覆盖圈半径-纸碟半径）]×100%

2 结果与分析

2.1 药剂室内抑菌试验结果

室内抑菌试验结果中，无论是采用纸碟法还是平板划线法，各供试药剂对猕猴桃溃疡病原菌的抑制作用差异均较大（表1、表2）。其中乙蒜氯霉效果最好，纸碟法试验中3种稀释倍数条件下所产生的抑菌圈均大于等于2.2 cm；其次为新田秀才6号及农用硫酸链霉素，100倍稀释条件下产生的抑菌圈均为1.8 cm；春雷霉素、铜制剂、荧光假单胞杆菌、硫酸铜钙的抑菌效果较差。平板划线法试验中，乙蒜氯霉效果最好，所有浓度均无生长；其次为新田秀才6号、农用硫酸链霉素、中生菌素及叶枯唑，仅1 600倍稀释药液的处理中有零星病菌生长。

2.2 药剂室内毒力测定结果

经过室内抑菌试验后，筛选出对猕猴桃溃疡病菌抑制效果较好的6种药剂，分别进行室内毒力测定，所得EC50的大小是衡量药剂毒力大小的重要指标，EC50越小表明药剂的毒力越强。各试验药剂的抑菌效果差异明显（表3），乙蒜氯霉对猕猴桃溃疡病菌的抑制效果最好，EC50为36.34 mg/L；其次为新田秀才5号和农用硫酸链霉素，EC50分别为83.21 mg/L和92.34 mg/L。铜制剂、荧光假单胞杆菌和硫酸铜钙的效果较差，EC50均超过1 000 mg/L。

3 小结与讨论

猕猴桃溃疡病是一种毁灭性病害，该病在万州发生日益严重，目前尚没有一种方法能够有效控制，该病如不及时防治，易在短时期内暴发成灾。目前化学药剂防治仍是猕猴桃溃疡病的重要防治措施，尽管其存在抗药性及环境污染等方面的问题，但从目前的发展情况来看，化学防治仍占主导地位。本研究通过对多种常见杀菌剂进行室内抑菌试验及室内毒力测定，以期能找到有效防治万州猕猴桃溃疡病菌的针对性药剂。

杀菌剂的防治可分为化学保护、化学治疗和化学免疫。杀菌剂毒力测定通常是在特定条件下进行，其结果可作为评估药剂效果的一个重要参考值[8]。本试验筛选出了乙蒜氯霉、新田秀才6号及农用硫酸链霉素，证明这3种药剂对万州猕猴桃溃疡病菌的抑制作用均较好，其中以乙蒜氯霉的效果最佳。在生产中，可选用这3种药剂直接对猕猴桃溃疡病进行施药，但在实际施药过程中，还应考虑施药时间、田间气候条件等因素。为延缓植物抗药性的产生，建议应将此3种药剂交替使用。

参考文献：

[1] 黄宏文.猕猴桃研究进展[M].北京：科学出版社，2000.

[2] 雷 庆.猕猴桃溃疡病的病原分类、噬菌体及发生规律研究[D].四川雅安：四川农业大学，2007.

[3] 王振荣，钱子华.猕猴桃溃疡病主要发病条件研究[J].安徽农业科学，1998，26（4）：347-348.

[4] 刘绍基，王忠肃，唐显富，等.四川省苍溪猕猴桃溃疡病的发生规律[J].中国果树，1996（1）：25-26.

[5] 宋晓斌，王培新，张星耀，等.陕西猕猴桃病虫害发生与危害的调查分析[J].西北林学院学报，1998，13（3）：79-84.

[6] 张 锋，陈志杰，张淑莲，等.猕猴桃溃疡病药剂防治技术研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2005，33（3）：71-75.

[7] 严 杰，罗海波，陆德源.现代微生物学实验技术及其应用[M].北京：人民卫生出版社，1997.

[8] 姚廷山，周常勇，胡军华，等.3种杀菌剂对柑橘溃疡病菌的室内毒力测定[J].江西农业大学学报，2009，31（6）：1026-1029.