氟苯尼考纳米晶的研制及表征

陈胡羚，辛怡霖，侯佳琪，唐 熙，王虹雅，李青云，张 欣，李引乾*

(1.四川省北川羌族自治县动物疫病预防控制中心，四川 北川 6227502；2.西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨陵 712100)

氟苯尼考(florfenicol,FFC)是目前临床上应用广泛的动物广谱抗菌药[1-3]，在生物药剂学分类系统(biopharmaceutics classification system,BCS)中属于低溶解度、高渗透性的药物。将药物通过纳米技术制成纳米晶体，可以有效改善药物的溶解度[4-5]、溶出度[6-8]及生物利用度，改善药物的吸收，降低药物残留，保障食源性动物的安全性[9-10]。乳化溶剂挥发法是制备药物纳米晶的常用技术之一[11-12]，采用乳化溶剂挥发法制备纳米晶时，影响纳米粒径大小的因素主要有有机相与水相的体积比、匀浆的速度和时间、匀质的压力和次数以及使用的表面活性剂浓度等[13]。乳化溶剂挥发法的优势就在于原理及操作简单、制备的纳米晶稳定。目前已有多种FFC的剂型，但尚无采用乳化溶剂挥发法制备氟苯尼考纳米晶(florfenicol nanocrystal,FFC-NC)的研究。因此，本研究拟采用乳化溶剂挥发法制备FFC-NC，为FFC-NC的制备提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂FFC(FB2002051)，江苏恒盛药业有限公司；FFC标准品(H1715060)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆188(T24J10Z80481)，上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇(191127)，四川西陇科学有限公司；乙酸乙酯(20191222)，天津市富宇精细化工有限公司；N,N-二甲基乙酰胺(20190613)，苏丹Ⅲ(20190506)、三水合亚甲基蓝(20190402)、光谱纯溴化钾(20191226)，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 处方工艺本试验采用乳化溶剂挥发法[11]，以泊洛沙姆188/乙醇/乙酸乙酯作为纳米乳体系制备FFC-NC。将3～5 g FFC原粉溶解于100 mL乙酸乙酯，加入0.25 mL N,N-二甲基乙酰胺助溶，置于45℃的恒温水浴锅中水浴10 min后，用0.45 μm微孔滤膜除杂质得有机相。将泊洛沙姆188按对应比例添加至乙醇中，置于45℃的恒温水浴锅中，待泊洛沙姆188完全溶解，即得混合表面活性剂。以有机相和混合表面活性剂的体积比为1∶2充分混合均匀后，置于磁力搅拌器上搅拌，边搅拌边缓慢匀速滴入一定体积比的水相，制得FFC初乳。对FFC初乳进行高速匀浆和高压匀质后得透明的均一体系，即FFC纳米乳。然后利用旋转蒸发器将纳米乳中所含的乙酸乙酯、乙醇等有机溶剂通过旋蒸去除，得FFC纳米混悬液，将纳米混悬液在-60℃条件下冷冻干燥后，即得到FFC-NC。

1.3 单因素试验本试验筛选最优制备条件的主要依据为FFC纳米混悬液的粒径大小，在进行单因素试验前，首先根据多次预试验结果，确定有机相与混合表面活性剂的体积比为1∶2。单因素试验所考察的6个影响因子如下：有机相与水相的体积比、泊洛沙姆188的浓度、高速匀浆的速度与时间，高压匀质的压力与次数。

1.3.1有机相与水相体积比 采用5‰的泊洛沙姆188，高速匀浆速度为5 000 r/min，匀浆时间3 min，高压匀质压力为300 bar，匀质3次，以泊洛沙姆188作为冻干保护剂冷冻干燥制备FFC-NC。考察有机相与水相体积比(1∶1.0,1∶1.5,1∶2.0,1∶2.5,1∶3.0,1∶3.5,1∶4.0,1∶5.0)对FFC-NC粒径的影响。

1.3.2泊洛沙姆188的浓度 采用通过上述考察确定的有机相与水相的体积比，以高速匀浆速度为5 000 r/min，匀浆时间3 min，高压匀质压力为300 bar，匀质3次为固定条件，以泊洛沙姆188作为冻干保护剂冷冻干燥制备FFC-NC。考察表面活性剂泊洛沙姆188的浓度(2‰,3‰,4‰,5‰,6‰)对FFC-NC粒径的影响。

1.3.3匀浆速度 采用通过上述考察确定的有机相与水相的体积比及泊洛沙姆188的浓度，以高速匀浆时间3 min，高压匀质压力为300 bar，匀质3次为固定条件，以泊洛沙姆188作为冻干保护剂冷冻干燥制备FFC-NC。考察匀浆速度(1 000,3 000,5 000,7 000,9 000 r/min)对FFC-NC粒径的影响。

1.3.4匀浆时间 采用通过上述考察确定的有机相与水相的体积比、泊洛沙姆188的浓度以及匀浆速度，以高压匀质压力为300 bar，匀质3次为固定条件，以泊洛沙姆188作为冻干保护剂冷冻干燥制备FFC-NC。考察匀浆时间(1,3,5,7,9,11 min)对FFC-NC粒径的影响。

1.3.5匀质压力 采用通过上述考察确定的有机相与水相的体积比、泊洛沙姆188的浓度以及高速匀浆的速度与时间，以高压匀质3次为固定条件，以泊洛沙姆188作为冻干保护剂冷冻干燥制备FFC-NC。考察匀质压力(100,300,500,700,900,1 100 bar)对FFC-NC粒径的影响。

1.3.6匀质次数 采用通过上述考察确定的有机相与水相的体积比、泊洛沙姆188的浓度、高速匀浆的速度与时间以及高压匀质的压力大小为固定条件，以泊洛沙姆188作为冻干保护剂冷冻干燥制备FFC-NC。考察匀质次数(0,1,3,5,7,9 次)对FFC-NC粒径的影响。

1.4 粒径测定利用马尔文纳米激光粒度仪，对所制备的FFC-NC的粒径及多分散系数(polymer dispersity index,PDI)进行测定。操作步骤如下：将FFC-NC均匀分散于蒸馏水后，用移液器吸取1 mL于特定比色皿中，置于纳米激光粒度仪进行检测，重复测定3次，取平均值。

1.5 扫描电子显微镜观察对FFC原粉和FFC-NC用扫描电子显微镜做形貌分析。操作方法如下：用导电胶带将样品粘在样品座上，喷金后，利用场发射扫描电镜进行观察。加速电压为10 kV，图像放大倍数为104～6×104倍。

1.6 傅里叶红外光谱分析对FFC原粉、FFC-NC、泊洛沙姆188、FFC原粉与泊洛沙姆188的物理混合物(以下简称物理混合物)进行化学结构分析。操作方法如下：将样品干燥后用溴化钾(光谱级)稀释至1%，充分混匀研磨后，用压片机将其压成薄片后置于傅里叶红外光谱仪的样品盘上。在室温环境下，波长范围为400～4 000/cm条件下进行红外扫描分析。

1.7 X-射线衍射检测对FFC原粉、FFC-NC、泊洛沙姆188、FFC原粉与泊洛沙姆188的物理混合物的晶型结构进行分析。分别取适量样品于专用样品台，经轻压抹平后，置于D8 ADVANCE A25型X-射线衍射仪中进行检测。XRD的检测条件如下：衍射角5～60℃，扫描速率为11°/min，扫描步长为0.02°，扫描模式为2θ，扫描电压为40 kV，电流为40 mA。

1.8 差示扫描量热分析对FFC原粉、FFC-NC、泊洛沙姆188、物理混合物进行差示扫描量热分析。分别精密称取样品3 mg置于微坩埚中，盖上微坩埚盖经压制后，置于仪器检测。DSC的检测条件如下：升温范围20～240℃，升温速率10℃/min。

1.9 电位测定利用马尔文激光粒度仪，对制备的FFC-NC样品进行电位测定。分别将FFC和FFC-NC均匀分散于去离子水后，用移液器吸取1 mL置于比色皿中检测，重复测定3次，取平均值。

2 结果

2.1 单因素试验结果

2.1.1有机相与水相的体积比 根据预试验结果，将有机相与水相体积比的考察范围确定为1∶1～1∶5。

由图1可知，在有机相与水相比范围为1∶1～1∶3时，FFC-NC的平均粒径在259.3～703.2 nm之间；而当有机相与水相比例超过1∶3.5时，FFC-NC的平均粒径大于1 μm。在制备FFC纳米乳时发现，当有机相与水相比例超过1∶3.5时会产生大量气泡，也证实当水量过多时，FFC纳米乳的形成较差。综合结果发现，在有机相与水相的体积比为1∶2时，制得的FFC-NC粒径最小，平均粒径为(259.3±28.1)nm，多分散系数(PDI)的平均值为0.24±0.04，因此选择有机相与水相的体积比为1∶2 来制备FFC-NC。

图1 有机相与水相体积比对FFC-NC平均粒径的影响

2.1.2泊洛沙姆188浓度 本试验以泊洛沙姆188作为表面活性剂，其浓度同样影响着FFC-NC的粒径大小。通过大量预试验确定，泊洛沙姆188的浓度范围为2‰～6‰，其对FFC-NC平均粒径的影响见图2。结果显示，泊洛沙姆188的浓度过高或过低时，形成的FFC-NC的平均粒径相对较大。当泊洛沙姆188的浓度范围在3‰～6‰时，FFC-NC的平均粒径在251.9～642.3 nm之间。综合结果确定，在泊洛沙姆188浓度为5‰时，制备的纳米晶平均粒径为(251.9±11.2)nm，PDI的平均值为0.23±0.02。

图2 泊洛沙姆188的浓度对FFC-NC平均粒径的影响

2.1.3匀浆速度与时间 本试验控制其他因素不变的情况下，考察了匀浆速度为1 000～9 000 r/min对FFC-NC的平均粒径大小。由图3可知，在考察的1 000～9 000 r/min范围内，FFC-NC的平均粒径为242.6～365.0 nm。综合结果发现，在匀浆速度7 000 r/min时，纳米晶平均粒径为(242.6±3.5)nm，PDI的平均值为0.21±0.01。因此，确定FFC-NC制备的最佳匀浆速度为7 000 r/min。

图3 匀浆速度对FFC-NC平均粒径的影响

由图4可知，在匀浆时间为1 min时，平均粒径为344.2 nm，平均粒径相对较大；而在3～11 min范围内，平均粒径大小在230.3～264.2 nm之间，说明在此范围内匀浆时间对FFC-NC的平均粒径大小影响不大，在5 min时，制得的FFC-NC的平均粒径最小，为(230.3±8.5)nm，PDI平均值为0.18±0.02。因此，选择最佳匀浆时间为5 min。

图4 匀浆时间对FFC-NC平均粒径的影响

2.1.4匀质压力与次数 高压匀质可以使制得的FFC纳米乳更加均一稳定。根据预试验结果，确定匀质压力的考察范围为100～1 100 bar。

如图5所示，当压力为100 bar升至300 bar时，平均粒径由365.0降至225.0 nm；而当压力继续加大，在300～1 100 bar范围内时，发现平均粒径呈增大趋势，这说明压力过大，纳米乳滴遭到破坏。所以，选择300 bar为最佳匀质压力大小，此时的平均粒径大小为(225.0±8.7)nm，PDI平均值为0.24±0.02。

图5 匀质压力对FFC-NC平均粒径的影响

如图6所示，在匀质次数为1～9次范围内，平均粒径大小为226.1～322.5 nm，其中在匀质次数为3次时，平均粒径最小，为(226.1±11.3)nm，PDI平均值为0.29±0.03。因此，确定3次为制备FFC-NC的最佳匀质次数。

图6 匀质次数对FFC-NC平均粒径的影响

综上所述，制备FFC-NC的最佳条件：有机相与水相体积比为1∶2，泊洛沙姆188的浓度为5‰，匀浆速度和时间分别为7 000 r/min和5 min，匀质压力和次数分别为300 bar和3次。利用最佳条件制备得到的FFC-NC平均粒径为(226.1±11.3)nm，PDI平均值为0.29±0.03。

2.2 纳米晶粒径分布将FFC-NC用蒸馏水分散后的粒径分布图显示，采用最佳条件制备的FFC-NC粒径分布在141.8～243.0 nm范围内，纳米晶的粒径分布范围窄，且粒径分布均匀(图7)。

图7 FFC-NC粒径分布图

2.3 扫描电子显微镜观察FFC原粉与FFC-NC的扫描电镜图显示，FFC原粉呈大小不一的薄片状，其形态不规则。FFC-NC形态为不规则球体，粒径分布均一(图8)。

A.FFC;B.FFC-NC

2.4 傅里叶红外光谱分析红外光谱扫描结果显示在3 455 cm-1处为-OH伸缩振动吸收峰，3 320 cm-1处为-CONH-伸缩振动吸收峰，1 684 cm-1处为C=O伸缩振动吸收峰，1 535 cm-1处为-NH的弯曲振动和-CN的伸缩振动，1 276 cm-1处是-CN的弯曲振动和-NH的伸缩振动[14]。P188红外光谱图显示，在 3 460 cm-1处为-OH伸缩振动吸收峰，2 883 cm-1处为-CH伸缩振动吸收峰，1 108 cm-1处为-C-O-醚吸收峰[15]。可以看出，物理混合物的红外光谱图为FFC和P188红外光谱的叠加。FFC-NC的红外光谱图未出现新的吸收峰，说明制备过程中FFC与P188未发生化学作用，FFC的化学结构未发生改变(图9)。

图9 傅里叶红外光谱图

2.5 X-射线衍射检测对FFC原粉、泊洛沙姆188、物理混合物及FFC-NC进行X射线衍射分析，结果显示FFC原粉在2θ为8.10°，16.21°，19.69°，20.16°，21.01°，24.40°，26.85°，28.92°，31.75°和41.16°时具有较强的衍射峰[16-17]，表明FFC原粉具有特定且较强的结晶度。FFC原粉的XRD图与物理混合物的一致，表明辅料泊洛沙姆188的添加不会影响FFC的结晶形态。FFC-NC的XRD图中，FFC的特征衍射峰消失，在2θ为11.96°，17.62°，18.80°处有较弱衍射峰，表明FFC-NC的晶型结构发生改变(图10)。

图10 X-射线衍射结果

2.6 差示扫描量热分析对FFC原粉、泊洛沙姆188、物理混合物及FFC-NC进行差式扫描量热分析，结果显示FFC原粉的熔点峰出现在153.7℃，泊洛沙姆188的熔点峰出现在55.6℃。FFC和泊洛沙姆188的熔点峰在物理混合物中均存在。FFC-NC的DSC图中不存在FFC和泊洛沙姆188的熔点峰，在115.1℃附近和151.3℃附近有极微弱的峰，此结果进一步证明FFC-NC的晶型结构发生改变(图11)。

图11 差示扫描量热分析结果

2.7 电位测定结果经测定，FFC纳米混悬液的电位为-(23.18±0.35)mV，而FFC混悬液的电位为-(9.67±0.47)mV，说明FFC纳米混悬液的稳定性更好，一般来说，电位在-20 mV左右，混悬剂能保持长期稳定。

3 讨论

将药物制成纳米晶体，不仅能大大改善药物的溶解性能，相较于纳米粒、脂质体，纳米晶还具有更高的载药量，其作为一种中间体，可加工成片剂、胶囊、注射剂等剂型[18-19]。采用乳化溶剂挥发法制备纳米晶时，制备纳米乳的有机相需要具有良好的挥发性。本试验依据已有配方[20]进行改良，保留了具有良好挥发性的乙酸乙酯作为有机相，此外，在药物设计和制备过程中，通过添加合理安全的药用辅料[21-22]和制备合适的剂型[23]，可以提高药物的性能。本试验选择泊洛沙姆188作为表面活性剂，是由于该非离子型表面活性剂的无毒无刺激性质[24]，助表面活性剂采用无水乙醇，其能有效帮助乳化，降低界面表面张力，使纳米乳更加稳定[25]。

方宇奇等[26]采用微型化介质研磨法制备得到了饱和溶解度和体外累积溶出度均明显高于FFC原粉的纳米晶，此外该团队[27]还考察了反溶剂沉淀法用于制备FFC-NC的效果。乳化溶剂挥发法也可用于制备纳米晶，但由于采用此法的难题在于纳米乳配方的筛选，目前还没有研究者用此法制备FFC-NC。本试验采用乳化溶剂挥发法经过优化制备的FFC-NC粒径为(226.1±11.3)nm，符合药物纳米晶的要求[28]，且PDI平均值为0.29±0.03，粒径分布范围窄。

本试验选用的对FFC-NC进行物理表征的方法包括对样品表面形貌及成分进行观察的扫描电镜法[29]、对样品化学成分及结构进行分析的红外光谱法、对样品晶型结构进行分析的X-射线衍射法及对样品热稳定性进行分析的差示扫描量热法。本试验FFC原粉的鉴定结果与已有研究结果一致[14,17,24]，这表明所建立的方法具有可靠性。

将FFC制成纳米晶，可以在增强其抗菌作用和生物相容性的同时，减少用药量，从而降低药物残留和环境污染，解决药物滥用、产生耐药性等问题，提升食源性动物产品质量，保障人与畜牧业生产可持续发展。该研究将为FFC的增溶作用研究提供新思路，丰富FFC的使用剂型，为兽医临床使用FFC提供新方法。