产气荚膜梭菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

缪西鹏，高 瑞，谢玉杰，熊新雪,2，赵 辉,牛耀祖，许立华*

(1.宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021；2.吴忠市利通区上桥镇畜牧兽医工作站，宁夏 吴忠 751100；3.宁夏威科嘉动物科技有限公司，宁夏 银川 750001)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)又名魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)，是一种革兰阳性杆状厌氧条件性致病菌。产气荚膜梭菌是人与动物肠道中的常在菌，其广泛分布于土壤、空气、水、食物、粪便等环境中[1]。产气荚膜梭菌的毒力与其产生的多种毒素和酶有关。到目前为止，已经确定了超过20种毒素和酶[2]。根据产生4种主要的致死毒素类型，可将产气荚膜梭菌分为5个血清型A(α)、B(α、β、ε)、C(α、β)、D(α、ε)和 E(α、ι)[3]。α毒素是产气荚膜梭菌中表达量最高的一种毒素，A、B、C、D、E型产气荚膜梭菌均有携带。

产气荚膜梭菌导致的牛猝死症在我国20世纪80年代就有零星发生，20世纪90年代以来，该病发病数量急剧增多，并广泛分布于全国各地，严重危害了中国畜牧业的健康发展[4]。该病发病急促并且死亡率较高。1994-1997年甘肃平凉地区牛发病1 860头，死亡1 826头；1990-2000年间海南部分市县发生“猝死症”死亡耕牛1 663头[5]。但目前国内检测产气荚膜梭菌的方法仍以血清学试验为主，以2010年国家质量监督检验检疫总局公布的《国境口岸产气荚膜梭菌毒素检测方法》(SN/T 2709-2010)为例，目前实验室对于产气荚膜梭菌毒素的检测仍是以家兔肠袢试验、反向间接血球凝集试验、琼脂双扩散试验及酶联免疫吸附试验(ELISA)等传统试验方法为主。这些试验方法不仅存在由于主观判断导致结果可靠性不强的缺点，其所耗时间也较长。本研究利用设计4对特异性引物建立了可快速区分A、B、C、D、E型产气荚膜梭菌的多重PCR方法，相较于传统血清学试验方法有着更高的灵敏度与可靠性且采样更为简便。并利用本研究建立的方法对宁夏地区17个牧场疑似产气荚膜梭菌猝死牛的68份鼻拭子样进行了初步检测。

1 材料与方法

1.1 菌株产气荚膜梭菌参考菌株A型(CVCC2012)、C型(CVCC2038)、D型(CVCC81)、多杀性巴氏杆菌(CVCC447)、金黄色葡萄球菌(CVCC545)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。产气荚膜梭菌参考菌株B型(ATCC3626)、E型(ATCC27324)、致病性大肠杆菌(ATCC 35150)、停乳链球菌(ATCC12388)、肺炎克雷伯菌(ATCC13883)购自美国模式培养物集存库。

1.2 试验试剂DL1000 DNA Marker购自TaKaRa公司；2×SanTaq PCR Mix、Ezup 柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、Ezup 柱式口腔拭子基因组 DNA 抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；厌氧肉肝汤培养基、胰月示-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础(TSC)、D-环丝氨酸溶液、2.5 L厌氧产气袋、2.5 L厌氧产气包均购自青岛海博生物技术有限公司。

1.3 菌株的培养将冻干保存的产气荚膜梭菌参考菌株A、B、C、D、E型进行复苏。用酒精脱脂棉团擦净安瓿表面，待安瓿表面酒精挥发后，将安瓿的封口端移至酒精灯火焰上加热。用无菌水滴至加热的安瓿顶端使玻璃破裂,无菌镊子敲开安瓿顶端。用移液枪加入0.3～0.5 mL的厌氧肉肝汤培养基于安瓿管内，使冻干菌种溶解呈悬浮液。混匀后，将悬浮液移植于15 mL厌氧肉肝汤培养基在41℃水浴摇床200 r/min过夜培养。

1.4 临床样品宁夏地区17个牧场疑似产气荚膜梭菌导致猝死牛的68份鼻拭子。

1.5 引物的设计与合成根据GenBank公布的毒素α、β、ε、ι基因序列，利用软件Primer Primer 5.0设计4对特异性引物(表1),由上海生工生物工程有限公司进行合成，并将各引物浓度稀释至10 μmol/L。

表1 多重PCR引物序列

1.6 单项PCR检测方法的建立以A、B、C、D、E型产气荚膜梭菌参考菌株DNA为模板扩增α毒素基因片段；以B、C型产气荚膜梭菌参考菌株DNA为模板扩增β毒素基因片段；以C型产气荚膜梭菌参考菌株DNA为模板扩增ε毒素基因片段；以E型产气荚膜梭菌参考菌株DNA为模板扩增ι毒素基因片段。PCR反应体系为2×SanTaq PCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 补至20 μL。反应程序为94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，29个循环，72℃ 5 min总延伸。取10 μL PCR产物在2%琼脂糖凝胶中以110 V电压电泳40 min。电泳结束后，用凝胶成像系统观察结果并拍照。

1.7 多重PCR反应条件的优化

1.7.1引物浓度的优化 使用灭菌双蒸水将C、D、E型产气荚膜梭菌参考菌株的DNA质量浓度稀释至100 μg/L，各取1 μL混匀作为模板，优化4对引物(CPA、CPB、ETX、IOTA)终浓度的不同配比(表2)，反应体系为2×SanTaq PCR Mix 20 μL，上下游引物各4 μL，模板3 μL，ddH2O 补至40 μL。反应程序按1.6。

表2 引物终浓度的配比 mmol/L

1.7.2退火温度的优化 以引物浓度优化后的多重PCR体系，设置8个退火温度(48.0，49.1，51.3，54.6，58.7，62.1，64.0和65.0℃)进行优化。

1.7.3多重PCR特异性试验 分别以A、B、C、D、E、C+D+E型产气荚膜梭菌参考菌株DNA、金黄色葡萄球菌DNA、多杀性巴氏杆菌DNA、停乳链球菌DNA、肺炎克雷伯菌DNA、大肠杆菌DNA以及灭菌蒸馏水为模板，按照优化后条件进行多重PCR特异性验证。

1.7.4多重PCR敏感性试验 将产气荚膜梭菌参考菌株C、D与E型DNA等比例混合并将其质量浓度稀释至50 μg/L。将混合DNA按照20，2-1，2-2，2-3，2-4，2-5,进行梯度稀释后按照优化后的条件进行多重PCR进行敏感性验证。

1.7.5多重PCR可重复性试验 应用优化后的多重PCR，取C+D+E型产气荚膜梭菌参考菌株DNA在不同时间进行检测并且重复5次，进行可重复性验证。

1.7.6临床样品的检测 用Ezup 柱式口腔拭子基因组DNA抽提试剂盒对17个牧场疑似产气荚膜梭菌猝死牛的68份鼻拭子进行DNA的提取并用优化后的多重PCR进行检测。

2 结果

2.1 单项PCR扩增结果产气荚膜梭菌单项PCR扩增结果如图1所示，分别获得了预期大小的α(图1A)、β(图1B)、ε(图1C)以及ι毒素(图1D)。

A.α毒素；B.β毒素；C.ε毒素；D.ι毒素。M.DL1000 DNA Marker;1～5.A、B、C、D、E型产气荚膜梭菌参考菌株；6，7.B、C型产气荚膜梭菌参考菌株；8,9.B、D型产气荚膜梭菌参考菌株；10.E型产气荚膜梭菌参考菌株

2.2 多重PCR引物浓度的优化取不同浓度引物组合进行多重PCR，结果表明CPA、CPB、ETX、IOTA引物终浓度分别为0.25，0.25，1.00，2.50 mmol/L时，多重PCR效果最佳(图2)。

M.DL1000 DNA Marker;1～5.CPA、CPB、ETX、IOTA引物终浓度(mmol/L)组合分别为0.25，0.25，0.75，2.50；0.50，0.25，0.75，2.50；0.25，0.25，1.00，2.50；0.50，0.25，1.00，2.50；0.50，0.25，1.00，2.00

2.3 多重PCR退火温度的优化以引物浓度优化后建立的多重PCR体系，选用不同的退火温度(48～65℃)，结果表明，当退火温度在58.7℃时，多重PCR效果最佳(图3)。

M.DL1000 DNA Marker;1～8.退火温度分别为48.0，49.1,51.3,54.6,58.7,62.1,64.0及65.0℃

2.4 多重PCR特异性检测按照优化后建立的多重PCR体系，以A、B、C、D、E、C+D+E型产气荚膜梭菌参考菌株DNA为模板均扩增出了其对应条带。以金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、停乳链球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌DNA以及灭菌蒸馏水为模板均未扩增出条带(图4)。

M.DL1000 DNA Marker;1～6.A、B、C、D、E、C+D+E型产气荚膜梭菌；7～12.金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、停乳链球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌及灭菌蒸馏水

2.5 多重PCR敏感性检测按照优化后建立的多重PCR体系，当核酸质量浓度降至12.5 μg/L时，仍可清晰地扩增出α、β、ε、ι毒素基因相对应的条带。在核酸质量浓度降至3.12 μg/L时，仍可观察到α与ε毒素基因扩增出的条带。在核酸质量浓度降至0.78 μg/L时，α毒素基因对应的条带仍可隐约可见(图5)。

M.DL1000 DNA Marker;1～8.DNA质量浓度分别为50.00，25.00，12.50，6.25，3.12，1.56，0.78，0.39 μg/L

2.6 多重PCR可重复性检测用优化后建立的多重PCR体系在不同的时间进行5 次重复试验，结果相同(图 6)，表明其重复性良好。

A～F.分别为A、B、C、D和C+D+E型产气荚膜梭菌参考菌株；M.DL1000 DNA Marker;1～5.参考菌株DNA

2.7 多重PCR临床样品检测运用建立的多重PCR方法对68头猝死牛的鼻拭子提取DNA进行检测，结果显示，分离出的产气荚膜梭菌均为C型(图7)。

M.DL1000 DNA Marker;1～10.临床样品；9.阴性对照；10.阳性对照

2.8 国标试验方法对多重PCR结果阳性样品的检测对经过多重PCR检测结果为阳性的产气荚膜梭菌进行牛奶发酵试验(图8A)、动力-硝酸盐试验(图8B)、乳糖-明胶试验(图8C)。

1～5.多重PCR结果阳性细菌;6.大肠杆菌；7.鼠伤寒沙门菌

3 讨论

随着近年来我国畜牧业的高速发展，由产气荚膜梭菌引起的牲畜猝死对畜牧业的健康快速发展造成了严重的威胁。除此以外，其还可以通过污染的食品引起人的气性坏疽[6]。产气荚膜梭菌作为存在于多种动物肠道内的正常菌群，传统的涂片镜检与生化试验不仅费时费力而且在疾病诊断方面存在片面性，已不适应当今对疾病快速精准检测的要求。随着分子生物学的快速发展，不断探索快速、高效、精准、特异、敏感的检测方法[7-9]。

本研究建立的多重PCR方法不仅可以快速准确地鉴定是否为产气荚膜梭菌所导致的疾病，并且可以根据其外毒素类型进行分型鉴别。在病料采样环节，仅需采集病畜的鼻拭子，不再需要对病畜进行解剖采样。不仅大大地减少了采样环节的工作量，更有效地降低了在病畜剖解过程中对操作人员及牧场可能存在的风险。在特异性方面，与牧场中常见引起牛猝死症的5种细菌进行对比，结果5种细菌均未扩增出相应目的条带，证明该多重PCR方法具有较好的特异性。在敏感性方面，当核酸质量浓度降至12.5 μg/L时，仍可清晰地扩增出α、β、ε、ι毒素基因相对应的条带。在核酸质量浓度降至3.12 μg/L时仍可被观察到α与ε毒素基因扩增出的条带。在核酸质量浓度降至0.78 μg/L时，α毒素基因对应的条带仍可隐约看见，证明该多重PCR方法具有较强的敏感性。运用本试验建立的多重PCR方法对68头猝死牛的鼻拭子进行检测，结果显示，在52头牛的鼻拭子样中检测出了产气荚膜梭菌，并且均为C型产气荚膜梭菌，表明宁夏地区导致牛猝死的产气荚膜梭菌主要为C型，对今后相应疾病的防控具有一定的参考意义。