下呼吸道感染病原体检测方法及相关病原体研究

任燕飞 张 敏 杨 涛 李荣凯 梁 新

1.新乡医学院第五临床学院，河南新乡 453000；2.新乡医学院附属人民医院检验科，河南新乡 453000；3.新乡市第一人民医院心内科，河南新乡 453000；4.新乡市第一人民医院呼吸与危重症医学科，河南新乡 453000

下呼吸道感染包括支气管炎、肺部感染、支气管扩张合并感染、慢性阻塞性肺疾病等，引起下呼吸道感染的主要病原体有肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、支原体、衣原体、病毒等。免疫功能下降、患有其他系统疾病、环境变化、生活习惯等因素均对下呼吸道感染病原体有一定影响。选择合适的病原体检测方法对下呼吸道感染的进展及预后至关重要。本文对近年来病原体的常见检测方法及相关病原体流行情况进行综述，以期为临床选择合适的诊断方法提供帮助。

1 下呼吸道感染病原体检测的常见方法

1.1 病原菌培养法

一直以来，病原菌培养法作为感染性疾病的诊断标准，在疾病病原体诊断及药敏试验中发挥重要作用。该方法主要有以下作用：①对感染病原体做准确的检验。②对病原体耐药性进行试验。③与临床关系紧密，参与临床感染性疾病的探讨。④参与临床合理应用抗菌药物的管理。该方法的不足之处在于结果可受多种因素的影响，包括标本的收集过程、送检时间、接种过程的规范性、培养条件等因素。在临床工作中，有时需要多次取样送检才能检出阳性病原体。很难对疾病的早诊断、早治疗提供快速精准的检测结果。

1.2 血清学方法

血清学方法包括酶联免疫吸附测定、胶体金法、补体结合试验、间接免疫荧光技术、放射免疫技术等。其中，酶联免疫吸附测定双抗夹心法广泛应用于下呼吸道感染病原体的检测，具有特异性强、敏感度高、快速等特点。病原体入侵机体后刺激机体产生相应的抗体，由于免疫反应发生的延迟，抗体的检测并不及时。而在免疫力较低下的患者中，例如军团菌感染、弓形虫感染的血清学检查假阴性的发生率较高。在临床中往往不能依靠单一的血清学抗体来确诊某种病原体的感染。在一些特殊情况下（如对β-内酰胺类抗生素耐药），血清学试验不能作为唯一诊断性试验，需将血清免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）M 与聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）方法或培养法联合以增加检测的敏感度。除了检测相关病原体的抗原或抗体外，降钙素原（procalcitonin，PCT）和 C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）是临床实践中最常用的生物学标志物。但CRP 的特异性较低，在入住重症监护病房的患者中，CRP 对细菌性肺炎的诊断能力较低。一项Meta 分析显示，PCT 水平对区分细菌性和病毒性肺炎具有良好的敏感度，当病毒性肺炎继发细菌感染时，特异性为64%，PCT 区分病毒性和细菌性肺炎的鉴别能力优于CRP。

1.3 病原微生物的分子检测

下呼吸道感染病原学研究报告显示，应用传统诊断技术（微生物培养、血清抗体检测技术）对肺部感染患者病原体的检出率只有38%。21世纪以来，分子诊断领域成为研究热点，分子诊断技术不断提升下呼吸道感染病原体检测的特异性和敏感度。分子诊断是通过PCR 对病原体特定DNA 片段进行扩增，从而对病原体进行定量和定性诊断的技术。Gadsby等建立了利用多重荧光PCR检测多种病原体的方法，通过对249 例阳性样本的检测证实该方法的有效性。多重荧光PCR 比传统培养和血清学检查敏感度更高，但也导致难以避免的假阳性结果。反转录PCR 技术是将一条RNA 链逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR 进行DNA 扩增，在病毒检测领域应用广泛。但该方法不仅需要复杂的检测仪器、繁琐的检测步骤，还有严格的技术要求，且该方法极易产生实验室交叉污染，因此，很难大规模应用，尤其是基层医院。

1.4 质谱分析法

质谱分析技术比传统检验方法拥有更高的敏感度、检测更精准。蛋白质质谱技术是通过分析细胞中某些特定蛋白质的性质来评估疾病发生及演变过程。特别是当细胞内出现特异性较高的蛋白质时，可以直接做出相关诊断。随着质谱技术的不断发展，极大地缩短检测时间。其中飞行时间质谱涵盖1000 多种菌种数据库，在对传统检测较困难的奴卡菌、厌氧菌、放线菌等检测上作用更加突出。

1.5 16SrDNA 测序

16SrDNA 测序针对病原体细胞核糖体16SrDNA亚基，该基团是细胞进化和分类过程中产生的特异性生物学标志，并具有高度保守性，这使得该基团成为微生物鉴定的重要结构。该方法除应用于细菌鉴定外，还可对病原体菌落及构成比进行分析。16SrDNA 测序技术不依赖于传统微生物培养技术，但结果的准确性远高于传统培养法，且能够提高病原体数据的丰富性，在很大程度上提高下呼吸道感染病原体的检测能力。该方法的应用同样需要严格的实验室流程和规范操作，才能保证诊断上的准确度。

1.6 恒温扩增芯片技术

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是通过一系列特殊设计的DNA引物，加上高活性的聚合酶，对靶向DNA 链进行扩增。在该反应体系中，基因扩增通过DNA 链上的延伸反应的复制进行（即从3＇端-5＇端的循环延伸）。随后在高活性链置换DNA 聚合酶作用下使链置换DNA 合成不断循环，形成一种颈环结构。其可在65℃恒温体系下进一步扩增，故不需要调整反应温度即可完成核酸扩增，从而简化反应过程、提高检测效率。LAMP 可将不同病原体的DNA 固定在一张芯片中，且携带方便，避免对大型检测设备的依赖，同时该技术能一次性完成12 种病原体和1 种耐药基因的检测，且避免实验污染的风险。该方法只需要1 种酶即可在恒定温度下完成扩增。内引物的基本特征为扩增提供了远高于其他方法的特异性。LAMP 反应时间短，在1h 内即可完成扩增过程，从标本处理到报告结果仅需2h，与传统培养法相比，可极大地缩短检测时间。该方法操作简便且对实验室的要求较低，可在一般分子实验室进行。正是由于LAMP 的高灵敏度、高特异性、快速、准确等特点，逐渐成为分子诊断实验室重要的诊断工具。

2 常见病原体概述

2.1 耐碳青霉烯类肠杆菌科病原体

2017 年世界卫生组织发布一份抗生素耐药菌的清单。在该份清单中，耐碳青霉烯类和第三代头孢菌素的肠杆菌科是引起严重感染的常见病原体。随着碳青霉烯类抗生素作为肠杆菌科病原体感染治疗的一线用药被广泛使用，耐碳青霉烯类肠杆菌越来越多，且表现为多重耐药。耐碳青霉烯类肠杆菌的耐药机制主要为：①碳青霉烯类水解酶的产生，能够水解碳青霉烯类抗生素。②该类耐药菌膜蛋白结构发生改变，细胞膜通透性降低，使细胞内的抗生素浓度大大降低。③细胞膜药物结合青霉素蛋白数量改变，从而细胞膜对碳青霉烯类抗生素的结合能力减弱。耐碳青霉烯类肠杆菌感染患者病程长、临床症状重，需要更长的治疗时间。对患有基础疾病或年龄较大的患者，往往会引发其他系统疾病，预后较差。

2.2 肺炎克雷伯菌

肺炎克雷伯菌的菌株毒性较强，可感染社区中的健康人群并引起严重感染，如严重肺部感染、化脓性感染、脑膜炎等。随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，肺炎克雷伯菌能够编码并产生碳青霉烯酶，使其具有很高的耐药性。肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶β-内酰胺酶是A 类丝氨酸碳青霉烯酶，是在肺炎克雷伯菌中发现的最常见的碳青霉烯酶。

2.3 大肠埃希菌

大肠埃希菌是存在于人类大肠的正常菌群。因机体免疫力低下、误吸等原因导致的由大肠埃希菌引起的感染很多，包括新生儿败血症或脑膜炎、腹泻、尿路感染、肺部炎症等。致病性大肠埃希菌菌株的致病机制包括黏膜部位的定植、宿主防御的逃避、繁殖和宿主损伤。大多数致病性大肠埃希菌菌株留在细胞外，但侵袭性大肠埃希菌能够入侵上皮细胞和巨噬细胞并在细胞内复制病原体。既往研究表明，中国65%的大肠埃希菌临床分离株产生超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamases，ESBL）。产生ESBL 的菌株对β-内酰胺类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素具有耐药性，并导致医院和社区获得性感染。ESBL 可通过结合、转化和转导促进耐药基因在细菌中的传播，导致严重的医院感染。ESBL 的流行类型在不同地区并不相同，临床上应予以重视。

2.4 肺炎支原体及肺炎衣原体

肺炎支原体及肺炎衣原体均可引起非典型肺炎。支原体肺炎发病率较高的是儿童和年轻人，其典型的特点是发病缓慢、持续咳嗽。研究表明，在与哮喘相关的各种感染中，肺炎支原体与哮喘的严重程度和治疗抵抗有关，并有可能在喘息性疾病中独立发挥作用。肺炎衣原体作为一种能够引起呼吸系统疾病的细胞内病原体，还与心血管疾病的发展密切相关，关系比较密切的是动脉粥样硬化，其与冠心病的发生风险呈正相关，因此，对存在心血管危险因素的易感人群应予以重视。对肺炎支原体的实验室诊断，通常同时使用抗体检测和核酸扩增（通常是PCR）。各种检测方法对病原体的确诊存在局限性，应将实验室数据与临床和（或）流行病学数据相结合，为疾病诊疗提供帮助。

3 病原体流行特点

下呼吸道感染病原体分布在各国并不相同。地理区域、年龄、研究时期等不同因素会影响下呼吸道感染的发病情况。在成人中，呼吸系统疾病、糖尿病、心血管疾病和慢性肝病是增加社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）风险的最常见合并症。值得注意的是，男性患CAP 的风险高于女性，尤其是在重症监护病房，这可能与解剖结构、行为、社会经济和生活方式的差异有关。在欧洲，CAP的年发病率估计为每1000人1.07～1.20例，在65 岁以上且男性居多的人群中可增加到每1000 人14 例。年龄因素对呼吸道感染有重要意义，其中30 岁以上人群受到支原体感染的机会大幅增加。有研究发现，从重症肺部感染患者的痰标本中分离出的病原体以革兰阴性菌为主，其中肺炎克雷伯菌占比最高（21.65%），该菌能够长期存活于医院内各种环境中，当患者免疫力低下时感染，可引起交叉感染。感染了革兰阴性杆菌的患者更容易感染耐甲氧西林葡萄球菌。而铜绿假单胞菌感染则更容易发生在患有支气管扩张、囊性纤维化等严重结构化疾病的患者中。此外，感染的严重程度、病原体类型存在地域差异。与美国相比，欧洲的肺炎球菌发生率更高。亚洲一项CAP 的综合研究显示，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌是西方国家的常见病原体，亚洲地区则以金黄色葡萄球菌较为常见。

4 展望

尽管越来越多的抗生素在感染性疾病的治疗中发挥重要作用，但下呼吸道感染仍是人类健康的巨大威胁。因地域、年龄、性别等因素的差别，病原体的种类、疾病的治疗及预后各有不同。随着抗生素的广泛使用，病原体的耐药性也逐年增加，因此，在合理应用抗生素的同时，早期、准确、快速的检测方法对疾病的预后具有重要意义。本文概述了近几年应用广泛的病原体检测方法，对下呼吸道感染相关病原体、流行病学特点等进行了总结，以期为下呼吸道感染的诊断、治疗及流行病学调查提供借鉴。