阳离子脂质体-siRNA 复合物对K562 细胞凋亡诱导的作用机制

王保全 陈江涛 申智慧 周黎明 李文倩 史朝辉 翟巧玲 张永州

1.河南大学淮河医院药学部，河南开封 475004；2.河南大学淮河医院普外科，河南开封 475004；3.河南省肿瘤医院血液科，河南郑州 450009；4.河南大学郑州颐和医院药学部，河南郑州 450047

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是指细胞在发展进程中高度保守的、由双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的、同源信使RNA（messenger RNA，mRNA）高效特异性降解的现象。其作为基因治疗的一种新模式，始终是当前肿瘤防治研究的热点话题，在治疗上，RNAi 通过递送小RNA 双链结合体，包括内源性微RNA、外源性干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA），短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）等实现基因干预效应。但siRNA 进入人体后易被人类血清中的核糖核酸酶家族降解，且由于siRNA 自身电荷特异性难以进入正常细胞内，所以对siRNA 递送体系的研究是将siRNA 应用于临床治疗的一大挑战。基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体质粒转染效率高，但对人体毒性过大影响其临床应用；非病毒载体可填补病毒载体的部分不足，近年来备受重视。如脂质体介导的基因组转化与病毒载体比较，优势凸显。阳离子脂质体携带的正电荷可中和siRNA 带有的负电荷，形成具有紧密结构的复合物，极大地延长循环时间，促进siRNA 递送。本研究以K562 细胞为研究对象，选择阳离子磷脂、硫酸鱼精蛋白、小牛胸腺DNA，制备新型阳离子脂质体-siRNA 复合体，观察其对K562 细胞生长的影响，并探讨其可能的分子机制。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

1,2 二油酰基-3-三甲基氨基丙烷（美国Sigma公司），胆固醇、小牛胸腺DNA、琼脂糖（上海生物工程有限公司），DNA-Marker（上海生物工程有限公司），吖啶橙（美国Sigma 公司），反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒（大连宝生物公司），胎牛血清（美国Introgen 公司），RPMI-1640 培养基（美国Hyclone 公司），二甲亚砜（DMSO，上海生物工程有限公司），MTT 细胞增殖与毒性检测试剂盒（杭州碧云天公司），聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（美国Bio 公司），JEM-4000透射电子显微镜（日本岛津公司），FTS-3000 傅里叶红外光谱仪（美国戴尔公司），其他试剂均为分析纯，根据bcr/ablmRNA 碱基序列5′-AAGCGUUC AAGCUUCAGCGGCAGGUA-3′设计siRNA；所有序列和引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.2 实验细胞

K562 细胞（购自河南省肿瘤医院）在含100ml/L胎牛血清、100U/L 青霉素、100mg/L 链霉素的RPMI-1640 培养基中，放置于37℃、50ml/L CO的培养箱中传代，每隔3～5d 传代1 次，取对数期细胞以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）调整浓度至2×10/L 进行试验。

1.3 方法

1.3.1 空白脂质体的制备 采用逆向蒸发法制备，将磷脂与胆固醇（摩尔比3∶1，2∶1，1∶1）置于25ml 茄形瓶中，超声溶入5ml 氯仿，旋蒸15min（水浴25℃，压力0.06MPa）形成均匀的分散膜，加入5ml HO，置于旋蒸仪上旋蒸水合50min（水浴50℃，常压），超声5min，过0.45/0.22μm 滤膜，以HEPES和100mmol/L NaCl 稀释后备用。

1.3.2 脂质体-siRNA 复合物的制备、表征 混合小牛胸腺细胞DNA 和siRNA，添加不同配比的硫酸鱼精蛋白（按siRNA 与小牛胸腺质量比为1∶0.5～2.1），再添加空白脂质体（按siRNA 与磷脂比值为1∶100～1000），室温下孵育15～20min，孵育后的脂质体-siRNA 复合物固定在碳支持膜上，以负染剂（20ml/L 磷钨酸）洗染约20min，使用JEM-4000EX透射电镜观察脂质体复合物形态。

1.3.3 脂质体-siRNA 复合物对K562 细胞生长的抑制作用 取对数生长期K562 细胞，以2×10/L 的密度接种于96 孔板上，每孔接种2×10个细胞，放置于37℃、500ml/L CO培养箱中培养12h 后，分别加入100、150、200、250、300μmol/L 的脂质体-siRNA复合物，以不加任何药物的K562 细胞混悬液为对照组，并设有调零孔（只含RPMI-1640 培养液），每组设4 个复孔，持续培育24、48 和72h 后，每孔加入20μl MTT 试剂，在培育箱中持续培育4h 后，弃去培养液，加入二甲亚砜200μl，摇床上震荡10min，将酶标仪调零，测定值，实验重复3 次，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=（1-处理组值/对照组值）×100%，重复测量3 次取平均值。

1.3.4 脂质体-siRNA 复合物在K562 细胞中表达的荧光显微镜观察 实验另设空白对照组、单siRNA 组、Lipofectamine+siRNA 组、脂质体+siRNA 组和脂质体-siRNA 复合物组（siRNA 以荧光标记），将各递送系统与K562 细胞孵育12h 后从培养箱中取出，弃去培养基，预冷PBS 洗涤，40ml/L 多聚甲醛固定45min，PBS 再洗涤，加入20mg/L 的PI 染色液30min后以PBS 洗涤，加盖玻片以甘油封片，置于荧光显微镜下观察。

1.3.5 脂质体-siRNA 复合物对K562 细胞凋亡的影响 收集K562 细胞和脂质体-siRNA 复合物处理48h 后的K562 细胞，700ml/L 乙醇4℃固定过夜，预冷PBS 洗涤细胞3 次，加1g/L 核糖核酸酶A 200μl，37℃孵育30min，加入100μg/l 碘化丙啶染色液800μL，混匀，4℃避光静置30min 后进行检测，上流式细胞仪测定DNA 水平，分析细胞周期分布直方图。

1.3.6 K562 细胞bcl-2、bax、caspase-3 蛋白表达的检测 将K562 细胞接种在培养皿中，待细胞处于对数生长期且细胞密度为80%时，将脂质体-siRNA 复合物加入不同的培养皿中，并将最终浓度调整为100、150、200、250、300μmol/L。培养48h 后，在4℃下离心15min，收集细胞，添加细胞裂解液以收集总细胞蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度，制备100g/L SDS-PAGE 凝胶电泳2.0～2.5h。膜转移2h后，将蛋白质转移到硝酸纤维膜上，用50g/L TBST制备的脱脂乳密封1h。滴加一抗bcl-2、bax（1∶200稀释）、caspase-3（1∶1000 稀释），4℃孵育过夜，随后回收一抗并以TBST 洗涤膜3 次，每次5min。使用ECL 超敏溶液进行发光显影，用GAPDH 检测作为内部参考。ImageJ 软件分析目标蛋白和内部参考蛋白的灰度值，蛋白质相对表达=目标灰度值/内部参考灰度值。

1.3.7 实时荧光定量RT-PCR 检测K562 细胞内mRNA的表达 采用一步法提取细胞总RNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA 质量，分光光度计测定RNA 浓度。根据试剂盒的操作进行cDNA 逆转录。实时荧光定量PCR 检测bcl-2、bax 和caspase-3 基因表达，用MGB 标记bcl-2、bax 和caspase-3 基因，用FAM 标记GAPDH 基因，扩增条件：95℃预变性2min，再变性15s，复性60s，共40 个周期，每次设置多个试管作为阴性对照，以GAPDH 为内标，10g/L 琼脂糖凝聚电泳后，通过GIS 数字凝胶图像处理系统获得PCR 产物的吸光度值，以各组bcl-2、bax 和caspase-3的值/GAPDH 的值表示各mRNA 表达水平，各引物和探针序列见表1。

表1 相关因子引物及引物序列

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 脂质体-siRNA 复合体对K562 细胞的生长抑制作用

MTT 法检测结果显示，不同浓度的脂质体-siRNA 复合物对K562 细胞均具有抑制作用，浓度为100、150、200、250、300μmol/L 的脂质体-siRNA复合物作用48h 后对K562 细胞的抑制率分别为（21.10±3.55）%、（35.32±5.21）%、（63.89±5.61）%、（90.54±8.51）%和（85.75±4.79）%，浓度为250μmol/L 的脂质体-siRNA 复合物对K562 细胞的抑制作用最强（＜0.05），见图1。

图1 脂质体-siRNA 复合物对K562 细胞的生长抑制作用

2.2 脂质体-siRNA 复合物对K562 细胞周期的影响

固定脂质体-siRNA 复合物浓度为250μmol/L（实验组），实验组的G期细胞显著多于对照组（＜0.05），S 期和G/M 期细胞显著少于对照组（＜0.05），见表2。

表2 两组细胞周期分布比较（，%）

2.3 荧光显微镜观察siRNA 的入胞效果

荧光显微镜观察FAM标记siRNA各组递送系统转染K562 细胞12h 后入胞效能，结果显示，单siRNA组具有一定的入胞效能，但远低于其他各组入胞效能，小牛胸腺DNA 和鱼精蛋白可显著提高siRNA 入胞效能，且新型脂质体-siRNA 复合物具备较大的质粒转染能力（＜0.05），见图2。

图2 各组脂质体-siRNA 复合物荧光显微镜观察结果（FAM 荧光标记，×200）

2.4 脂质体-siRNA 复合物对bcl-2、bax 和capase-3 mRNA 表达的影响

脂质体-siRNA 复合物在转染K562 细胞后48h，随着复合物浓度的增加，K562 细胞bcl-2 mRNA 表达水平显著下降，bax、caspase-3 mRNA 表达水平显著升高（＜0.05），其中脂质体-siRNA 复合物浓度为250μmol/L 时，bcl-2、bax 和caspase-3 mRNA 表达水平变化最为显著，见图3。

图3 脂质体-siRNA 复合物对bcl-2、bax 和capase-3 mRNA 表达水平的影响

2.5 脂质体-siRNA 复合物对bcl-2、bax 和caspase-3蛋白质表达的影响

蛋白质印迹法检测结果显示，脂质体-siRNA 复合物转染K562 细胞48h 后，对细胞内bcl-2、bax和caspase-3 蛋白表达均呈现不同程度的影响，随着复合物浓度的增加，bcl-2 蛋白表达水平逐渐下降，bax、caspase-3 蛋白表达水平逐渐增加（＜0.05），见图4。

图4 蛋白质印迹法检测bcl-2、bax、caspase-3蛋白表达水平

3 讨论

慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）是一类造血干细胞异常的克隆性疾病，bcr-abl融合基因的异常表达是其显著特征。研究显示，bcr-abl 基因是由9 号染色体上abl 与22 号染色体上bcr 相互易位形成的融合基因，该基因编码的BCR-ABL 融合蛋白具有较强的酪氨酸激酶活性，可通过多个信号转导途径使细胞发生恶性转化。伊马替尼是首个用于临床的选择性酪氨酸激酶抑制剂，可大大提高CML 患者的生存率，然而长期用药后患者会出现耐药情况。因此，在酪氨酸激酶抑制剂治疗的基础上，寻找新的治疗策略意义重大。

siRNA 作为基因治疗的一种新模式，始终是当前肿瘤防治研究的热点。siRNA 长约21nt，且3’端有两个碱基凸出，可解决反义核酸技术治疗难题。但裸siRNA 进入人体后易被核糖核酸酶降解，因此，选择合适的载体就显得十分重要，阳离子脂质体作为DNA、RNA 载体常用于基因治疗，研究发现，阳离子脂质体与肿瘤新生血管内皮上带负电荷的蛋白聚糖、磷脂、过唾液酸化和过糖基化膜蛋白发生静电作用，从而形成被动靶向作用。Khan 等研究显示，以脂肪酸合成酶为靶点，通过使用人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）抗体修饰的脂质体包裹siRNA 可抑制HER-2 阳性乳腺癌细胞增殖。Atu027 是一种由阳离子脂质体AtuFECT01 介导的siRNA 释放的脂质体释放系统，可抑制蛋白激酶N3 在血管内皮中的表达，减轻肿瘤炎性反应，在临床试验中表现出良好的抗肿瘤活性。动物研究发现，阳离子脂质体能使药物在肿瘤部位富集，抑制肿瘤组织生长，从而延长动物生存时间，降低肿瘤药物毒性。本研究采用转染性较强的阳离子脂质体，设计针对K562 细胞中特异的bcr-abl 基因siRNA 并体外化学合成，用阳离子脂质体包裹siRNA，体外转染CML K562 细胞，与商品化转染试剂相比较，取得良好的实验效果，为新药研发及临床治疗、预防CML 提供了一个新的研究方向。