微卫星不稳定性与结直肠癌关系的研究

何佳明 张 燕

河北医科大学第三医院胃肠外科，河北石家庄 050011

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见消化道恶性肿瘤，根据世界卫生组织癌症统计数据显示，2020 年我国新发CRC 达到56 万人，死亡人数达到29 万人，发病率逐年增加。随着细胞分子标志物与 CRC 相关性研究的深入，微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）逐渐成为研究热点之一，本文通过对MSI 定义、分类、与CRC 发病的关系、检测方法及治疗特点进行综述，旨在加深临床对MSI 与CRC 关系的认识。

1 微卫星不稳定性

微卫星由数个甚至数十个多次重复核苷酸构成短串重复的DNA 片段，其在复制时容易发生突变造成新的微卫星等位基因出现，使得整个基因片段结构和长度发生改变，从而产生微卫星遗传不稳定性。错配修复（mismatch repair，MMR）主要识别和纠正微卫星复制中的错误，这种修复机制缺失则会导致某些调控细胞生长或凋亡的重要基因在复制时发生的错误得不到修正，复制错误随基因遗传不断积累，从而导致正常细胞逐渐向恶变的方向发展。目前根据MSI 发生频率可分为微卫星高度不稳定（high-frequency microsatellite instability，MSI-H)、微卫星低度不稳定（low-frequency microsatellite instability，MSI-L）和微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）。MSI-H 肿瘤被发现具有密集的免疫浸润和丰富的细胞因子环境特征，与肿瘤的发生关系密切。

2 微卫星不稳定性与结直肠癌

MSI 作为CRC 重要的发生机制之一，目前仅在肿瘤细胞中被发现，而在肿瘤周围正常组织细胞中未发现MSI。10%～20%的CRC 存在MSI，MSI 在CRC 中发生机制主要有两种，一种是MMR 突变失活，约占CRC 的3%，可分布于整个DNA 序列而无显著热点，常见于林奇综合征（lynch syndrome，LS）；另一种是MMR 启动子CpG 岛超甲基化从而引起下游基因错配修复错误，约占CRC 的12%，常见于散发性结直肠癌（sporadic colorectal cancer，SCRC）。

2.1 林奇综合征

LS 是遗传性CRC 中最常见的一类常染色体显性遗传病。其发生机制主要与MLH1、MSH2、MSH6和PMS2 基因突变有关，其中MLH1、MSH2 基因突变约占MMR 基因突变的90%，且MLH1 较MSH2更为常见，而MSH6 和PMS2 约占10%，其中PMS2占比不到5%。此外，MSH2 蛋白表达缺失也可由上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EPCAM）基因缺陷导致，研究证实EPCAM 基因缺陷可导致MSH2 基因启动子高甲基化而引起基因表观沉默。普通人群CRC 发生风险仅有5.5%左右，而在LS 患者发生风险则高达80%以上，其中90%以上的CRC 表现出MSI-H，约70%由MSH2 和MLH1基因突变造成。LS 患者各种恶性肿瘤发生风险增加，早期进行肿瘤基因筛查有助于诊断和干预。

2.2 散发性结直肠癌

既往研究证明启动子CpG 岛超甲基化可使抑癌基因突变失活，这种现象在人类肿瘤基因中普遍存在。SCRC 患者通常发病年龄较大，平均发病年龄67 岁，常见于女性，主要为低分化癌，多伴有淋巴细胞浸润。研究发现在SCRC 中肿瘤实性体积的增大可导致MSH2 和MSH6 的表达错误率升高。在SCRC 中，MSI-H 的患者通常存在BRAF 基因突变，BRAF 基因突变与肿瘤转移扩散相关，是转移性CRC较强的生存预测因素。在LS 中，MSI 患者并未检测到BRAF 基因突变，当MLH1 发生缺失时，应检测BRAF 基因以排除LS。

3 常用检测方法

美国及中国的CRC 临床诊疗指南均推荐MSI检测用于所有的CRC 患者。常用MSI 状态或MMR蛋白表达预测CRC 患者的疗效，常用检测方法主要包括：①多重荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）及毛细管电泳技术检测MSI 位点，②免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）法检测MMR 蛋白表达；③二代测序（next-generation sequencing，NGS）平台的MSI 算法。多重荧光PCR及毛细管电泳技术是检测MSI 的“金标准”，2 个或2个以上微卫星位点表现不稳定性可诊断为MSI-H；仅有1 个微卫星位点表现不稳定性可诊断为MSI-L；没有任何位点表现不稳定性可诊断为MSS。PCR 技术是目前敏感度较高的检测方法，可检测到常见突变基因以外的突变造成的MSI。IHC 通过4 种最常见MMR 蛋白（MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2）与特异性检测抗体结合进行免疫检测，MMR 蛋白反映了MSI 状态，若MMR 基因任何一种表达错误，则认为是错配修复蛋白表达缺失（deficient mismatch repair，dMMR）；4 种基因表达全部阳性，则认为错配修复蛋白正常表达（proficient mismatch repair，pMMR），一般认为MSI-H 相当于dMMR，而MSI-L或MSS 相当于pMMR。目前基于NGS 平台的MSI算法有MSI sensor、MSI FOne、MSI ColonCore 和MANTIS 等，主要检测单核苷酸、插入缺失及基因融合等变异，与PCR 检测技术相比，NGS 的优势在于具有高通量性，1 次可检测数百至数百万个基因，甚至可检测整个基因组的变异情况，对指导治疗及预测预后具有重要的临床价值。

4 指导疾病治疗

4.1 MSI 状态用于结直肠癌的预后判断

研究显示MSI-H 的CRC 患者预后显著优于MSS 患者，包括SCRC 和LS，Popat 等通过Meta分析发现，MSI-H 患者在各个分期中生存风险均较低，在接受CRC 根治术的患者中，MSI-H 的肿瘤患者预后要显著优于MSS，肿瘤远处转移复发的趋势相对更低，且晚期MSI-H 患者的死亡率低于MSS。Benatti 等研究发现Ⅱ～Ⅲ期的MSI-H 的CRC 患者与MSS 和MSI-L 相比有生存优势，然而Ⅳ期患者则生存状况较差。Roth 等对CRC 术后患者的预后进行随访和研究，MSI-H 的CRC 患者预后优于MSS患者，其无病生存期（disease-free survival，DFS）和总生存（overall survival，OS）更长，可能是肿瘤淋巴细胞浸润过高所致。Venderbosch 等研究发现，MSI-H/dMMR 患者DFS 和OS 均较短，且BRAF基因突变概率高于pMMR 的患者，而BRAF 突变的CRC 患者往往预后不良，可能是由BRAF V600E 突变所驱动，使得Ⅳ期CRC 患者生存期缩短。一项Ⅲ期临床研究表明MSI 状态与患者生存预后的关系主要与MSI 是散发还是遗传相关，且可用BRAF 突变区分SCRC 和LS。研究发现MSI-H 肿瘤多发生于右半结肠，分化程度较差，黏液腺癌和印戒细胞癌多见，肿瘤体积较大，具有密集的免疫浸润和丰富的细胞因子的环境特征，其与肿瘤的发生关系密切。MSI-H 的CRC 患者的淋巴结和远处转移概率均较低，Ⅰ/Ⅱ期CRC 患者DFS 较长，与MSS 比较，MSI-H 的Ⅲ期CRC 患者预后较好，淋巴结转移和远处转移较少。

4.2 MSI 状态用于结直肠癌的治疗效果

4.2.1 化疗 对于局部进展期结直肠癌（locally advanced colorectal cancer，LACRC），dMMR 或MSI-H 状态的Ⅱ期CRC 患者接受根治术后预后相对较好，5 年生存率高达80%，优于MSS 和MSI-L 患者，有更长的OS 和较低的转移率，但无法从单药氟尿嘧啶类辅助治疗中获得较好疗效，因此，所有Ⅱ期CRC 患者治疗前均应进行MMR 检测。在新辅助治疗方面，有研究报道新辅助化疗对大多数dMMR/MSI-H的CRC 患者不敏感。Morton报道dMMR/MSI-H组结肠癌患者FOxTROT 新辅助化疗的有效率仅为4.7%，其中73.6%的肿瘤组织并未退缩。一项关于FOLFOX 作为直肠癌新辅助化疗的研究显示，dMMR/MSI-H 直肠癌病例中有29%发生肿瘤不良进展，而pMMR 组则未见肿瘤进展。对LACRC的治疗，目前美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南推荐术前新辅助放化疗（neoadjuvant chemoradiotherapy，NCRT）+根治性全直肠系膜切除术（total mesorectal excision，TME）+辅助化疗作为治疗方案，虽然NCRT可降低局部复发率，但患者的远期生存并未改善，MSS 组患者术后病理完全缓解（pathological complete response，pCR）率显著高于MSI-H 组，其中约20%的患者对NCRT 并不敏感，且术后不良反应和并发症较多，如吻合口瘘、膀胱功能障碍、性功能障碍。

4.2.2 免疫治疗 免疫治疗的出现，为肿瘤治疗开辟了新的道路。研究发现程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）/程序性死亡蛋白配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）对dMMR或MSI-H 晚期CRC 患者具有较好的治疗效果，PD-1/PD-L1 抑制剂可诱导T 细胞活化，重新激活T细胞对肿瘤的免疫应答系统，加强对肿瘤细胞的监测与清除，从而发挥抗肿瘤作用，以此达到肿瘤术前降期、提高R0 切除率和术后病理缓解率及降低术后复发率。KEYNOTE016 研究首次报道PD-1 抑制剂用于经标准治疗后无效的晚期CRC 患者，该项研究纳入41 例患者，其中dMMR CRC 患者11 例、pMMR CRC 患者21 例、其他CRC 患者9 例，结果显示11 例dMMR 患者的客观缓解率（objective response rate，ORR）为62%，而pMMR 患者ORR 为0。dMMR患者的中位无进展生存（progression-free survival，PFS）和OS 也长于pMMR 患者。初步证明PD-1 抑制剂对dMMR 的晚期肿瘤患者有效。Check Mate 142 研究结果表明MSI-H/dMMR CRC 患者均可从纳武利尤单抗单药或纳武利尤单抗+伊匹木单抗治疗中获益，ORR 分别为31.1%和55.0%；12 个月的PFS 率分别为50%和71%；12 个月OS 率分别为73%和85%，且两药耐受性均良好。再次肯定PD-1抑制剂对dMMR CRC 的作用。由于90%以上的LS表现出MSI-H，所以PD-1 抑制剂能使LS 患者直接受益。KEYNOTE-177 研究是一项关于一线治疗应用帕博利珠单抗治疗MSI-H/dMMR CRC 对比标准化疗（化疗±贝伐珠单抗或西妥昔单抗）的研究，共307 例MSI-H/dMMR CRC 患者入组，结果表明帕博利珠单抗对MSI-H/dMMR 患者姑息治疗12 个月和24 个月的PFS 率分别为55.3%和48.3%，均分别高于标准化疗组的37.3%和18.6%。帕博利珠单抗治疗的ORR 为43.8%，高于标准化疗的33.1%。表明帕博利珠单抗可作为MSI-H/dMMR CRC 患者的一线治疗方案。虽然中国尚未有大量MSI-H/dMMR CRC 患者应用PD-1 抑制剂治疗的研究数据，但基于国际上已有的临床数据及2021 版NCCN 指南推荐，PD-1 抑制剂可应用于适合的MSI-H/dMMR 晚期CRC 患者。虽然目前免疫检查点抑制剂仍在探索之中，但对dMMR/MSI-H CRC 与免疫检查点抑制剂辅助治疗正进行着不同模式的研究，如免疫联合化疗、双免疫治疗、免疫联合靶向，相信在未来CRC 的免疫治疗将探索出一种新的道路。

5 结语

综上所述，MSI 是CRC 发生的重要途径之一，是CRC 早期筛查和诊断的重要方法，是评估患者预后的重要预测手段及选择辅助治疗方法和免疫治疗效果的预测标志物。因此，应对所有的CRC 患者进行MSI 状态或MMR 蛋白表达检测。除此之外，如子宫内膜癌、肺癌、胆囊癌等也常伴有MSI-H。总之，加深临床对MSI 与CRC 关系的认识，对给予患者正确合理的诊断、治疗及干预具有积极作用。