缺氧诱导因子在小肠缺血再灌注损伤中的研究进展

图拉妮萨·喀迪尔 罗杰 廖师师 孟庆涛

武汉大学人民医院麻醉科，湖北武汉 430060

小肠缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）是由小肠扭转、绞窄型肠梗阻、急性肠系膜缺血、小肠移植、潜在失血性休克、严重创伤、败血症等引起的外科急症。IRI 时可引起一系列病理生理变化，如自由基生成增多、膜脂质过氧化、细胞内钙超载、线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）打开、线粒体分裂、细胞结构破坏等，这些病理生理过程导致肠黏膜屏障受损致使细菌和内毒素从消化道入血，刺激中性粒细胞、巨噬细胞释放大量炎性介质和氧化因子，形成炎症风暴，引起全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），甚至引起多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），最终死亡。缺氧时，缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）作为转录因子，通过调控血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）、糖酵解酶、葡萄糖转运蛋白和其他靶基因的表达以恢复血液循环，促进血管生成和血管重构，减轻炎性反应，调控能量代谢以改善组织氧合和细胞在低氧环境中的生存，从而发挥促进细胞存活、对抗炎症、抑制凋亡的保护作用。HIF-1α 对保护肠道免受IRI 至关重要。因此，调控HIF-1α 及其下游靶基因的表达有助于减轻缺血性损伤。本文针对HIF-1α 在IRI 中的作用及相关机制进行综述。

1 缺氧诱导因子转录因子家族

1.1 HIF 结构

HIF 是碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）蛋白转录因子超家族的成员，由氧敏感的α-亚基（HIF-α）和组成性表达的β-亚基（HIF-β）组成。缺氧调节的亚基HIF-α 在哺乳动物中存在三种亚型（HIF-1α，HIF-2α 和HIF-3α）。组成性表达的β 亚基（HIF-1β，HIF-2β 和HIF-3β）不受氧含量的影响。HIF-1α 几乎存在于所有的细胞内，其表达受到氧状态的调控，而HIF-1β 基本上是持续表达，HIF-1α 与HIF-1β 结合形成二聚体后发挥生物学功能。

1.2 HIF 表达调控及功能

HIF 的稳定和转录受2-氧戊二酸依赖的双加氧酶家族调控，该家族包括脯氨酸羟化酶（proline hydroxylase domain，PHD）和天冬酰胺羟化酶即缺氧诱导因子抑制因子（factor inhibiting HIF，FIH）。在正常氧浓度条件下，PHD 利用氧、2-氧戊二酸、铁（Fe）和抗坏血酸作为辅助因子，在脯氨酸残基上羟基化HIF-1α，羟基化的HIF-1α 被肿瘤抑制因子复合物蛋白酶体降解。

除了受PHD 的负调节外，HIF 的激活还受FIH调控。与PHD 类似，FIH 也能感知氧浓度的变化，促使C-TAD 处的HIF-1 天冬酰胺803 残基羟基化，并阻止其与转录辅助激活因子cbp/p300 结合，降低HIF 的转录活性。

在缺氧条件下，氧气在线粒体氧化磷酸化过程中被消耗，使PHD 活性降低，FIH 的催化活性也受到抑制，促使HIF-α 在胞质中积累，并转运到细胞核，与HIF-1β 二聚。HIF-α 与HIF-1β 在细胞核二聚化后形成复合体，该复合体与cbp/p300 共激活因子相互作用，与启动子区域中缺氧反应元件结合，并激活基因转录。受HIF 调控的缺氧细胞通过转录和转录后调控机制适应缺氧，对抗应激。

作为缺氧适应的关键调节因子，HIF 以组织特异性的方式调节500 多个具有多种生物学功能的人类基因，如VEGF、EPO、内皮素、热激蛋白90、一氧化氮合酶、凋亡/细胞周期阻滞等基因。缺氧条件下，HIF 优先诱导糖酵解酶和丙酮酸脱氢酶表达，从而减轻缺氧给组织带来的损伤，促进血管生成，组织修复再生，其与活性氧（reactive oxygen species，ROS）之间有密切而复杂的联系，除此之外HIF 与免疫、炎症、代谢性疾病、缺血性疾病也有紧密联系。

2 小肠缺血再灌注损伤与缺氧诱导因子

2.1 HIF 在小肠IRI 中的抗氧化作用

IRI 发生在器官的血液供应中断（缺血），然后重新建立血供（再灌注）时，导致线粒体ROS 的“暴发”。在缺血期间，能量代谢从脂肪酸氧化转换到糖酵解，使组织维持细胞活力的时间延长。再灌注过程中，线粒体不仅产生高水平的ROS，影响DNA 氧化并诱导促凋亡途径，且打开MPTP，进一步促进ROS 生成，形成恶性循环，称为ROS 诱导ROS 释放（ROS-induced ROS release，RIRR）。可通过恢复pH 和钙超载来维持MPTP 的状态，但其会增加溶质的渗透性，导致线粒体膜电位的崩溃和破坏。RIRR的破坏作用协同增加缺血后的氧化应激。

肠道是食物消化和吸收的主要场所，其主要依赖基底外侧的Na/K-ATP 酶的驱动作用，因此肠上皮具有较高的能量需求，对血流减少也很敏感。当发生肠缺血时，首先影响绒毛尖端和结肠表面的上皮细胞。随着缺血持续时间的延长，小肠绒毛尖端肠腔的细胞和结肠隐窝表面上皮最先失去与基底膜的连接，并逐渐丧失向隐窝基底延伸的细胞。长时间的缺血，促使锚定在一起的紧密连接破裂，导致上皮细胞从基底膜中分离出来，进入肠腔。肠道缺血性损伤后，再灌注诱导氧气流入，从而导致ROS过度产生。IRI 通过激活肠上皮细胞、多形核中性粒细胞、巨噬细胞诱导炎性反应，进一步促进ROS 产生，使炎症进一步恶化。由此可见肠IRI 过程中多种反应均可引起ROS 的产生，选择性地减弱与疾病相关的ROS 形成已成为IRI 治疗的一个研究热点。

2019年诺贝尔奖获得者Gregg L.Semenza详细描述了HIF 在缺氧条件下维持氧化还原稳态的机制。HIF-1 通过调节乙酰辅酶A 合成抑制ROS 的产生，缺氧条件下，HIF 通过激活丙酮酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1)和乳酸脱氢酶A（lactic acid dehydrogenase A，LDHA），将丙酮酸转化为乳酸，阻止丙酮酸向乙酰辅酶A 的转化。HIF-1 还可通过降低脂肪酸氧化，从而减少乙酰辅酶A 的合成。

HIF 通过调节线粒体蛋白和自噬来抑制ROS 的产生。缺氧条件下HIF-1 诱导Bcl-2/腺病毒E1B19kDa相关蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B19kD interacting protein 3，BNIP3）和编码微RNA（microRNA，miR）的基因表达，BNIP3 与Beclin-1 竞争性结合Bcl-2，释放Beclin-1 诱导线粒体自噬。作为代谢适应性反应，线粒体自噬促进细胞在长期缺氧条件下的存活，从而减少线粒体ROS 的产生和细胞凋亡。

HIF 通过调节缺氧细胞的抗氧化防御抑制ROS的产生。在缺氧条件下，HIF 增加葡萄糖到丝氨酸的转化和线粒体还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的产生，将谷胱甘肽从氧化形式转化为还原形式以防止电子传递链产生的ROS 增加。

由于ROS 的生成在IRI 的发病机制中起重要作用，抗氧化已成为缺血性疾病治疗的首要目标。ROS作为IRI 的关键分子靶点，值得深入研究。

2.2 HIF 与炎症

缺血再灌注时中性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞被激活，并聚集到缺血缺氧的组织部位释放多种介质[肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1），血管紧张素Ⅱ，血小板活化因子和白三烯-4]促进白细胞和内皮细胞黏附，黏附的白细胞迁移到组织中破坏微血管屏障，导致细胞水肿，甚至凋亡。白细胞与内皮细胞的黏附是缺血再灌注引起组织损伤和功能障碍的早期迹象，可导致微血管并发症和组织损伤。

在炎症的刺激下，HIF 通路被激活并通过多种途径发挥抗炎作用。研究表明，核因子κB（nuclear factor Kappa B，NF-κB）是在缺氧条件下HIF-1α 表达的直接调节剂。长时间缺血产生的ROS 激活NF-κB 通路，导致HIF-1α 基因启动子和HIF-1α mRNA 增加。NF-κB 也可以直接上调HIF-1β，促进HIF-1α 与HIF-1β 二聚发挥生物学功能。

缺氧和炎症导致NF-κB 和CCAAT/增强子结合蛋白δ 活性增加，该蛋白与HIF-1α 启动子结合并调节HIF-1α 信号传导，从而促进炎性细胞浸润和炎性细胞因子分泌。炎性细胞因子还可通过P38 丝裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK）和磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）磷酸化上调HIF-1α。此外，炎性细胞因子TNF-α诱导VHL-HIF-1α 相互作用，并通过NF-κB 依赖性途径增加HIF-1α 积累。反之，HIF-1α 通过触发NF-κB 相关的细胞炎症和抑制细胞凋亡来增强嗜中性粒细胞存活。

HIF 也可通过调节Bcl-2 家族基因，与p53 相互作用，靶向线粒体酶抑制炎症以减少细胞死亡。因此，炎症和缺氧之间的相互作用在感染、无菌炎症、缺血性损伤中具有重要意义。

2.3 HIF 与能量代谢

缺氧和三羧酸循环中间产物会抑制PHD 活性，从而稳定HIF 蛋白活性，促使蛋白与共激活因子发生相互作用，诱导靶基因转录。HIF 通过参与糖酵解、脂肪酸氧化、线粒体和过氧化物酶体代谢在能量代谢中发挥重要作用。

在低氧条件下，细胞通过诱导参与能量代谢基因的表达来适应缺氧应激。低氧时，HIF 复合物与DNA 结合以启动HIF 靶基因的转录。这些转录产物减少氧化磷酸化，促进糖酵解从而影响线粒体代谢。低氧也可以通过调节三羧酸循环中间产物（如α-酮戊二酸和琥珀酸）的浓度直接影响线粒体代谢。除了在三羧酸循环中的作用外，琥珀酸还作为α-酮戊二酸依赖性PHD 羟基化反应的副产物调节PHD 活性和HIF 稳定性。

在缺氧期间，由于电子传递链中断，氧化还原状态受到干扰，也会产生ROS，HIF-1α 通过限制三羧酸循环和上调线粒体蛋白PDK1 和BNIP3 以减轻ROS 对细胞的毒性。

2.4 HIF 与miR 之间的关系

miR 是非蛋白质编码RNA 分子，通过与信使RNA 的3′UTR 结合以控制信使RNA 的稳定性和翻译，从而降低蛋白质水平。缺氧相关miR 在细胞凋亡、炎症和氧化应激中具有关键作用。HIF 结合位点位于缺氧相关miR 启动子区域，通过调节缺氧反应基因和缺氧相关miR 调节基因表达。

缺血再灌注诱导肠道miR 表达水平发生改变，提示miR 在IRI 的发生、发展过程中具有重要作用。miR 表达变化与潜在IRI 中的氧化应激、细胞凋亡、自噬、炎症和上皮屏障功能障碍密切相关。一方面，在IRI 后一些miR 上调。如miR-146 上调可减少各细胞系中Toll 样受体4（Toll-like receptor，TLR4）、白细胞介素-1 受体相关激酶（interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK），显著降低上皮细胞凋亡和组织损伤。当肠上皮细胞缺氧时，TLR4 和IRAK 表达上调，导致固有免疫反应激活，NF-κB 活性增强，促进炎症因子释放及细胞凋亡，而miR-146 可以降低TLR4 水平并减少IRAK 积累，减少细胞凋亡和组织损伤，减轻免疫反应，从而保护肠上皮细胞免于凋亡。IRI 时miR-21、miR-351、miR-381、miR-6682、miR-34a 等多种miR 上调超过2 倍。这些上调的miR通过多种途径影响氧化应激、细胞凋亡和引起炎症。另一方面，多种miR 在IRI 后下调。如miR-29b-3p表达水平在体内和体外IRI 后均降低，促进肿瘤坏死因子受体相关因子3（tumor necrosis factor receptorassociated factor 3，TRAF3）表达，激活转化生长因子-α 活化激酶1 磷酸化，从而增加NF-κB、IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平以促进炎症，同时BAX 表达上调，Bcl-2 表达下调触发细胞凋亡，进一步促进肠损伤。miR 的研究为开发预防和治疗IRI 的创新药物提供一种新思路。

3 小肠IRI中缺氧诱导因子的治疗靶点及作用

鉴于HIF 的多效性，考虑利用HIF 治疗IRI 是非常有前途的一种方法。目前，HIF 激活剂主要用于正常氧浓度下稳定HIF 表达。

HIF-1 抑制剂分为直接抑制剂和间接抑制剂。直接抑制剂更具特异性，可直接影响HIF-1α/HIF-1β二聚化、HIF-1α/DNA 结合、HIF-1α-p300 相互作用或与其他重要蛋白质的相互作用。但直接抑制剂一般为肽类，不能口服使用，且代谢不太稳定，故而不适用于临床。间接抑制剂通过与其他靶点的直接相互作用影响HIF-1α 翻译、稳定和降解。目前使用的大多数小分子HIF-1α 抑制剂是间接抑制剂。

3.1 HIF 在缺血预处理中的应用

缺血预处理是指在组织长时间缺血前对其进行短暂、重复的缺血和再灌注，是一种内源性的对器官随后出现持续性缺血损伤的保护措施。HIF-1α 通过诱导CD73 表达、增加腺苷和腺苷A2b 受体水平，可模拟缺血预处理的作用。目前正在进行临床试验的化合物中，大多数是通过小分子脯氨酸羟化酶抑制剂（prolyl hydroxylase inhibitor，PHI）抑制二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxalylglycine，DMOG）依赖的羟化酶家族活性来调节HIF 的诱导和积累，即在缺血前给予DMOG 类似物激活HIF 通路，增强间充质干细胞促血管新生能力，并防止随后缺血发作造成的组织损伤。

3.2 HIF 在缺血后处理中的应用

多项研究表明HIF 在缺血后处理中也有一定作用。在临床实际中，各种缺血性疾病难以预测，患者多在缺血发作期间来院就诊，因此，与缺血预处理相比，缺血后处理更具有临床价值。在缺血后给予DMOG 类似物可保护组织免受缺血损伤，其机制与减少ROS 形成、抑制caspase-3 活性、激活EPO和VEGF，从而增加毛细血管密度，减轻缺血性损伤有关，可改善患者预后。有趣的是，一种临床上常用的吸入麻醉剂七氟醚，可通过增加HIF1-α 和减少caspase-3，而起到缺血后处理的作用。

3.3 HIF-1α 与肠IRI 的其他研究

随着对IRI 相关机制和HIF-1α 及其下游基因的不断研究，除以上提到DMOG 类似物外，还有其他PHI 被广泛用作PHD 抑制剂和HIF 激活剂，如铁离子螯合剂去铁胺可激活离体细胞和体内的HIF；醋酸酯对PHD-2 的高亲和力可应用于急性缺血性模型。PHI GSK360A 可稳定HIF-1，增加HIF-1 靶基因PDK1和己糖激酶Ⅱ表达，并将细胞代谢重新编程为有氧糖酵解，从而减少IRI 期间ROS 生成和MPTP 开放。然而，大多数PHI 可抑制2-氧戊二酸依赖的双加氧酶，但对HIF、PHD 却是非选择性的。因此，开发针对HIF、PHD 的特异性PHI 有待进一步研究。

此外，在预处理治疗中，低水平的氧化剂可能有一定保护作用，但高水平的ROS 则被认为是有害的，可导致细胞凋亡。虽然ROS 在IRI 中起重要作用，但抗氧化疗法不能预防相关疾病。因此，在不改变生理性ROS 的条件下，开发选择性地减弱与疾病相关ROS形成的抗氧化剂可对ROS介导的组织损伤和炎症有所帮助。

4 总结与展望

细胞在缺血缺氧情况下的适应性反应的潜在机制十分复杂，HIF 作为氧敏感转录激活因子发挥重要作用。HIF 在IRI 时与炎症、氧化应激、能量代谢、细胞凋亡、上皮细胞屏障功能障碍、转录调控存在相关性，缺氧靶向低氧信号通路在小肠IRI 中具有治疗潜力，为HIF 治疗IRI 提供了新的机会。针对HIF靶向治疗缺血性疾病已有一定的进展，深入研究其在疾病病理生理学及其与缺氧信号转导关系，对缺血相关疾病的预防和治疗具有重大意义。