SORL1基因多态性与阿尔茨海默病的相关性研究

包瑞婷， 戴莉莉， 周 涛， 吐玛热斯·塔外库力， 宋雨影， 卡力比努尔·赛买提， 哈斯也提·依不来音

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种复杂的、多因素的神经退行性疾病[1]，是导致老年人痴呆的主要原因，该病给患者、照顾者和社会带来了巨大的负担，随着人类预期寿命不断的延长，AD的发病率和患病率不断增加，这些事实突出了阿尔茨海默病成为未来国民主要健康负担的可能性，并强调了确定该病主要危险因素的必要性及确定诊断、治疗和预防目标的迫切性。AD大脑中表现出广泛的病理变化，包括神经元丢失以及细胞内神经纤维缠结中异常磷酸化的tau蛋白和细胞外由β淀粉样肽(Aβ)组成的神经炎斑块的积累，[2]血管异常[3]等。目前关于AD的治疗也集中在其神经病理特征[4]。为了调查潜在的阿尔茨海默病的遗传风险，大规模全基因组关联研究(GWAS)、候选基因研究和通路分析已经被广泛地进行[5]，自20世纪90年代初以来，分子遗传学研究已证实目前已有数百种基因与阿尔茨海默病的风险有关[6]。2004年 Scherzer等首次发现了山梨素相关受体1(SORL1)基因是与AD发生相关的候选基因后[7]，SORL1基因作为LOAD的易感基因于2007年开始被广泛研究[8]。目前已有大量研究证实SORL1与AD患病风险密切相关。SORL1是一种神经元载脂蛋白E受体，主要表达在中枢神经系统，近年来，SORL1的异常表达被认为只要与AD的发病机制有关[9]。因此研究SORL1基因变异对阿尔茨海默病发生发展的预测价值可能有助于更好的预防和治疗AD，目前有关SORL1基因多态性与AD相关性的探索已在很多种族、民族之间进行，但由于阿尔茨海默病是由遗传和环境因素共同作用引起，SORL1基因变异与AD的相关性在不同研究中的结果并不完全一致，所以，我们检测了来自新疆地区阿尔茨海默病患者及健康对照者SORL1的单核苷酸多态性(SNPs)，以确定这些基因座的基因型和等位基因频率与新疆地区AD发病的相关性。本实验结果将为阐明AD的发病机制和寻找新的治疗靶点提供依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象 我们选取在2016年8月-2018年6月期间就诊于新疆医科大学第二附属医院和乌鲁木齐市周边医院的131例阿尔茨海默病患者作为本研究的病例组。病例组患者年龄均≥65岁，平均(74.40±7.921)岁，其中男性61例、女性70例，维吾尔族72例，汉族59例，均为散发性阿尔茨海默病患者。同时间在新疆医科大学第二附属医院体检的健康人群中选取与病例组在年龄、性别、生活环境及方式、学历等方面相类似的非AD患者或健康志愿者128例作为对照组，年龄均≥65岁，平均年龄(75.20±7.857)，其中男性53例、女性75例，维吾尔族63例，汉族65例。并对两组受试者的性别、年龄、学历方面进行统计学分析，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

表1 AD组与对照组一般特征比较

本研究为病例对照研究，所有研究对象均签署知情同意书，通过新疆医科大学第二附属医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 标本收集 对所有受试者均采集清晨空腹肘静脉血3ml，使用抗凝剂后保存于-80 ℃冰箱，分批进行DNA提取。

1.2.2 基因组DNA的提取 用全血提取基因组DNA：将加用抗凝剂低温保存的血液放置室温下解冻，购买并使用TIANamp Genomic DNA kit提取试剂盒(北京天根生物技术公司)，严格按照试剂盒说明书进行DNA提取，所有样品提取DNA后，测定DNA浓度和纯度。

1.2.3 目的基因测定 在公共数据库NCBI(http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/SNP/)上查询并记录SORL1基因SNP基因座的标准序列，其位点序列号rs1010159、rs2282649、rs3824968、rs1699102、rs3781836、rs2070045、rs3781834、rs641120、rs689021、rs668387、rs12364988、rs985421。采用Primer Premier5．0软件设计本实验选用的SNP位点的KASP引物(见表2)，采用PCR扩增技术及DNA测序检测方法SORL1基因。委托北京博淼生物科技有限公司通过连接酶检测-聚合酶链反应(LDR—PCR)方法对SORL1基因多态位点进行基因分型。

表2 SORL1基因多态性位点引物序列

1.3 统计学分析

1.3.1 实验为病例对照，年龄为计量资料，若符合正态分布，两组比较采用t检验，若不符合正态，数据用中位数±四分位间距表示，采用Mann-WhitneyU检验。性别及文化程度为计数资料，采用χ2检验。

1.3.2 H-W吻合度检测采用Hardy-Weinberg均衡检验确定群体代表性。检测结果表示，SORL1基因型及等位基因的观望值和期望值之间无统计学意义(P>0.05)(见表3)。

1.3.3 基因频率和基因型的分布采用基因计数法，计数资料以例数和率(%)表示，采用SPSS26.0进行统计学分析，两组间相互比较采用χ2检验和(或)Fisher精确概率法。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SORL1基因rs1010159、rs2282649、rs3824968、rs1699102、rs3781836、rs2070045、rs3781834、rs641120、rs689021、rs668387、rs12364988、rs985421位点多态性比较结果 本实验中SORL1基因目标位点的基因型及等位基因检测结果符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)(见表3)。

表3 Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验结果[n(%)]

2.2 病例组与对照组SORL1基因rs1010159、rs2282649、rs3824968、rs1699102、rs3781836、rs2070045、rs3781834、rs641120、rs689021、rs668387、rs12364988、rs985421位点的基因型及等位基因分布的比较 由表4可见，本实验所选中的SORL1基因中的各个位点的基因型及等位基因的分布在AD组与对照组中相比较差异均无统计学意义，说明SORL1基因rs1010159、rs2282649、rs3824968、rs1699102、rs3781836、rs2070045、rs3781834、rs641120、rs689021、rs668387、rs12364988、rs985421位点多态性与AD无关(P>0.05)。

表4 病例组与对照组基因位点基因型及等位基因频率比较[n(%)]

2.3 AD患者SORL1基因rs1010159、rs2282649、rs3824968、rs1699102、rs3781836、rs2070045、rs3781834、rs641120、rs689021、rs668387、rs12364988、rs985421位点等位基因分布情况 散点图是根据DNA产物峰面积大小计算得到SNP位点所有分型点状图，本实验所有位点等位基因正常聚类图中2个纯合子分型根据产物峰高分别在聚类在靠近横、纵轴附近，在二者之间单独聚类的一组为杂合子(见图1)。根据散点图可见聚类良好。

注：No Call 未发现等位基因的病例个数

3 讨 论

在人类中，神经元山梨素相关受体(SORL1，又称SorLA或LR11)位于染色体11q23.2-q24.2的长臂上，全长177.49 kb，编码一个250 kD的膜蛋白，在中枢和外周神经系统神经元中均有表达，参与了物质在膜和细胞内、细胞器之间的细胞内运输[10]。目前研究已证明SORL1基因变异可明显增加晚发型阿尔兹海默病的患病风险。主要原因是研究发现在晚发型阿尔茨海默病患者脑组织中发现SORL1表达明显降低[11]、SORL1的表达减少与淀粉样多肽的产生增加有关、SORL1基因多态性与AD特异性脑结构(即海马和海马旁回)的萎缩有关[12]、SORL1缺陷神经元中Aβ多肽的增加，Aβ多肽的增加的原因可能部分是由于Aβ或APP由高尔基体转运到溶酶体的减少所致[13]。SORL1编码的蛋白质(SORLA)已被证明与老年斑的主要成分淀粉样蛋白-β的加工、运输和降解有关。SORL1还是载脂蛋白E/低密度脂蛋白受体家族的成员，具有分类和运输蛋白的功能，引导β-APP进入循环内体途径，导致AD老年斑的主要成分Aβ的产生。但SORL1的上述致病作用在不同人群的实验中的相关性不尽相同，可能原因是人群差异，或是生活环境差异，亦或是因为上述作用在不同人群中的影响不同，某些人群中呈现为致病性，而某些人群中影响不足以致病，我们称之为因果影响与修饰影响。

Cong等的一项meta分析表示，亚洲人群中单核苷酸多态性(rs1010159、rs641120)与阿尔茨海默病易感性之间的风险增加[14]。Ning等对144例中国LOAD患者和476例健康对照SORL1的6个SNPs(rs2070045，rs661057，rs668387，rs689021，rs3824968，rs2282649)进行了基因分型，结果发现SORL1中的3个SNPs rs2070045、rs3824968和rs2282649与样本中的LOAD显著相关[15]，其余3个SNPs rs661057，rs668387，rs689021与样本中的LOAD无关。Xue等为探讨SORL1 SNP rs2070045单核苷酸多态性(SNP)与LOAD的关系，对77例LOAD患者和100例对照人群进行病例对照研究，结果发现T等位基因携带者患AD的危险性显著高于对照组(OR=2.616，χ2=6.627，P=0.010)[16]。Liu等通过调查了在欧洲EOAD中发现的这11种SORL1变体，以及在欧洲祖先中的个体在大规模的EOAD和GWA中的负荷风险，发现rs2070045、rs1699102和rs3824968这三个基因变体可以显著调节人脑组织中SORL1的表达[17]。Wen等在日本对583例神经病理学特征的脑供体受试者(见表1)的SORL1基因的19个SNPs进行了基因分型，通过基于SNP的病例对照关联研究和多元Logistic回归分析，发现19个SNP基因型中有5个与LOAD有关：rs12364988，rs985421，rs4598682，rs3781834，rs3781836[18]。荷兰研究者在研究鹿特丹市研究的6741例参与者和伊拉斯谟鲁芬家族研究的2883例个体中测试了与阿尔茨海默病和认知功能的关联，未能发现SORL1基因与AD事件之间的关联[19]。目前SORL1基因多态性与AD之间的相关性的研究已在多国多民族间进行了复制研究，我们无法将研究结果一一例举，但通过相似的研究方法得出不同的研究而言，科学家们相信阿尔茨海默病是一种遗传上的异质性和复杂性疾病，这种差异可能是由于不同种族、不同群体、不同地区间遗传异质性的影响，也可能是其他遗传因素和环境因素协同作用导致的样本的差异。

在我们的实验研究中，我们对SORL1基因rs1010159、rs2282649、rs3824968、rs1699102、rs3781836、rs2070045、rs3781834、rs641120、rs689021、rs668387、rs12364988、rs985421位点的基因型及等位基因进行分组评估，结果发现差异均无统计学意义。目前有关新疆地区的研究已有2例，张玉洁等的研究发现SORL1基因2070045、rs3824968位点可能与新疆哈萨克族及汉族SAD无相关性[20]。另一例本实验组研究结果所得，对实验数据进行民族间分组讨论，认为SORL1基因rs378183、6rs3781834位点多态性与新疆汉族AD与维吾尔族AD无关[21]。由以上实验结果我们无法断定SORL1基因变异在新建人群不导致AD的发生，因为新疆是一个多民族聚居的地区，生活在这里的民族有47个，且地广人稀，我们的实验入组对象民族成分单一，仅包含了维吾尔族与汉族，我们实验对象的来源也单一，仅收集了乌鲁木齐市及周边少数地区的病例。考虑到以上几点，我们认为我们样本的代表性不足以证明整个新疆地区，我们无法否认SORL1基因与AD之间的关联性。因此我认为在新疆仍需要大样本、多中心、跨民族、跨区域的研究来证明SORL1基因与AD的关联性。

综上所述，我们的研究没有发现SORL1基因rs1010159、rs2282649、rs3824968、rs1699102、rs3781836、rs2070045、rs3781834、rs641120、rs689021、rs668387、rs12364988、rs985421位点的多态性与AD相关，导致该结果的原因可能是(1)样本量小、纳入民族单一、涵盖地域单一，希望未来能有大样本、多中心的研究。(2)AD是一种遗传上和环境上具有异质性和复杂性的疾病，不能用单一的因素解释其相关性。