ETFDH基因突变致核黄素反应性脂质沉积性肌病18例临床、病理和基因突变特点分析

钱 琪， 崔文豪， 瞿千千， 刘海燕， 陈 萍， 周亚光， 吕海东

脂质沉积性肌病(lipid storage myopathy，LSM)是由于脂肪酸氧化障碍引起脂质在肌纤维内聚集，导致骨骼肌无力和运动不能耐受为特征的一组遗传代谢性肌病[1]。由于LSM临床表现具有很大的异质性，仅以临床表现和常规的辅助检查常难以确诊，而肌肉病理和基因检测在LSM的临床诊断中起到了重要作用[2]。目前研究发现脂质沉积性肌病的相关基因有ETFA/B、ETFDH、SLC22A5、CPT2、ACADVL、PNPLA2、ABHD5等10余种，其中ETFDH基因变异所致的多酰基辅酶A脱氢缺陷症(multiple acyl coenzyme A dehydrogenation deficiency，MADD)是我国LSM最为多见的类型[3]。而且，这类LSM对核黄素治疗具有显著疗效，所以又称为核黄素反应性脂质沉积性肌病(riboflavin-responsive lipid storage myopathy，RR-LSM)。目前发现ETFDH基因变异有190多种类型[4]，而且具有较明显的地域和种族差异性[5]，国内相关研究认为南方和北方有各自的ETFDH基因突变热点，南方以c.250G>A为突变热点，北方为c.770A>G和c.1227A>C[6～9]，尚未见有关中原地区ETFDH基因变异特点的分析报道。我们神经肌病中心自1996年在河南地区最早开展肌肉病理检查以来，累计完成各类神经肌肉病病理诊断1200余例，诊断LSM 45例，其中完成基因检测证实为ETFDH突变所致的RR-LSM有18例。本研究总结这18例RR-LSM患者的临床和肌肉病理资料，并分析其ETFDH基因突变的特点，旨在提高临床医生对RR-LSM的认识，扩展ETFDH基因的突变谱系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2009年1月-2020年12月于我院就诊，经肌肉活检病理确诊和基因检测证实为ETFDH突变所致的18例RR-LSM患者的临床资料。男女各9例，发病年龄9～60岁，平均(29.83±13.44)岁，病程1 m～22 y，平均4.5 y。所有患者均无家族史，为散发病例。

1.2 肌肉病理检查 18例患者均在局部麻醉下开放性活检取材，其中肱二头肌7例，股四头肌9例，腓肠肌2例。肌肉标本经液氮固定冰冻切片，进行常规组织学和酶组织化学染色。染色包括苏木素-伊红(HE)、改良高墨瑞(MGT)、高碘酸Schiff反应(PAS)、油红“O”(ORO)、ATP酶(pH 4.2，4.3，10.6，10.8)、COX、还原型辅酶Ⅰ(NADH-TR)等染色。免疫组化采用En Vision法检测淋巴细胞CD4、CD8、CD20和CD68的表达，光镜下观察。

1.3 基因检测 经患者和家属知情同意后，对18例患者进行NGS IDT全外捕获测序。取外周静脉血4ml，送北京金准基因检测中心，提取血液DNA，捕获后的DNA样本进行Illumina NovaSeq高通量测序。测序数据经Illumina Sequence Control Software(SCS) 评估合格后，进行数据读取和生物信息学分析以鉴定ETFDH基因突变。

2 结 果

2.1 临床特点 18例患者中亚急性起病7例，慢性起病11例，均以肢体近端肌无力和运动不能耐受为主要临床表现。其中伴抬头无力14例，咀嚼肌无力9例，吞咽困难5例，恶心、纳差5例，肌肉疼痛3例，呼吸困难2例，有1例行呼吸机辅助呼吸治疗，1例伴有横纹肌溶解症。查体发现有椎旁肌萎缩6例，股四头肌萎缩2例。18例患者血清肌酶均有不同程度升高，肌酸磷酸激酶(CK)475～15620 U/L(正常为25～200 U/L)，乳酸脱氢酶(LDH)169～12358 U/L(正常为109～245 U/L)。肌电图检查：肌源性损害13例，肌源性合并神经源性损害2例，未见明显异常者3例。18例患者应用核黄素口服治疗，30～120 mg/d，临床均获得良好疗效。一般患者在治疗2 w后，肌无力症状即有明显好转，继续治疗4～6 w后，肢体肌力可恢复正常。本组18例患者应用核黄素治疗均获得痊愈，其中2例患者分别在停药后1 y和3 y症状有复发，再次使用核黄素治疗，仍然获得了良好效果。

2.2 肌肉病理特点 18例患者HE染色均可见肌纤维内有大量均匀分布的小筛孔样空泡，部分空泡融合成大泡或裂隙状(见图1A)，5例伴有不同程度的肌纤维变性坏死(见图1B)；油红O染色证实肌纤维内的空泡被大量红染的脂肪颗粒充填(见图1C)；改良Gomori染色有3例可见少量不整红边纤维(RRF)(见图1D)；ATP酶染色示Ⅰ、Ⅱ型肌纤维分布正常，空泡改变主要累及Ⅰ型肌纤维(见图1E)；NADH染色、PAS染色未见特异性改变。在5例伴有肌纤维坏死的患者中，有3例行淋巴细胞亚群免疫组织化学染色，结果为CD4(-)、CD8(-)、CD20(-)、CD68(+)(见图1F)。

A 示肌纤维大小基本正常，可见大量均匀分布的小筛孔样空泡(HE，×400)；B 可见有变性、坏死肌纤维，伴吞噬细胞浸润(HE，×400)；C 示肌纤维内有大量红染的脂肪颗粒堆积(ORO，×400)；D 部分病例可见不整红边纤维(RRF)(GT，×400)；E 可见Ⅰ、Ⅱ型肌纤维呈镶嵌式分布，无群组化现象(ATPase4.3，×200)。F 在变性坏死肌纤维内可见CD68(+)的巨噬细胞浸润(En Vision，×400)

2.3 基因检测结果 18例患者均检测到ETFDH基因突变。其中复合杂合突变15例(83.3%)，单一杂合突变2例(11.1%)，纯合突变1例(5.6%)。共发现20个突变位点(见表1)，其中19个变异位点为已知的致病性突变位点，而c.1115A>G为新发突变位点(见图2)。ETFDH基因的突变类型以错义突变最常见17(47.2%)，其次为移码突变2(5.6%)，无义突变1(2.8%)。在本组病例中出现频率最高的突变位点为c.770A>G，占等位基因的19.4%(7/36)，其次为c.1454C>G，占等位基因的8.3%(3/36)，再次为c.250G>A、c.360dupT、c.1395T>G、c.1281_1282del 和c.1227A>C，均占等位基因的5.6%(2/36)，其余位点突变占等位基因的2.8%(1/36)。

表1 RR-LSM患者ETFDH基因检测结果

图2 编号8患者ETFDH基因Sanger测序图，9号外显子上c.1115A>G为新发突变位点

3 讨 论

RR-LSM是一种临床上较为少见的肌肉病，由于其临床表现具有较强的异质性，很容易被误诊为炎性肌病、重症肌无力、肌营养不良症和胃肠道疾病等[10]。本组有8例患者因以颈伸肌和肢体近端肌无力为主要临床症状，血清CK明显升高，肌电图提示肌源性损害，所以均首诊为“多发性肌炎”。另有5例患者因肢体无力症状有波动，休息后症状可减轻，且伴咀嚼和吞咽肌无力，首诊被误诊为“重症肌无力”。还有些患者因伴随纳差、恶心和呕吐等消化道症状，化验肝脏转氨酶升高，被长期误诊为“肝炎”和“胃肠道病变”，由此可见LSM临床首诊时误诊的发生率较高。RR-LSM患者血清CK和LDH一般为轻到中度升高，本组有1例患者CK高达15620 U/L，考虑该患者合并有横纹肌溶解症导致CK值过度升高。有些患者LDH升高比CK更明显，甚至出现CK/LDH倒置现象，目前认为CK/LDH倒置亦是RR-LSM的一个重要特征[11，12]，它对于RR-LSM的早期识别和鉴别诊断有一定的临床意义。

肌肉活检是诊断RR-LSM的重要手段，在肌纤维中出现均匀的小筛孔样空泡和大量的脂质沉积是其特征性病理改变[13]。本组18例患者肌纤维中均可见到小筛孔样空泡和大量的脂滴沉积，其中3例患者在MGT染色中可见RRF，提示肌纤维内可能有异常线粒体堆积。有文献报道RR-LSM患者在治疗后肌纤维内的筛孔样空泡和脂滴沉积可明显减轻或者消失，提示肌纤维中脂质沉积的数量与临床症状有一定的相关性[14]。本组病例尽管没有在治疗后复查肌肉病理，但是我们观察到临床上肌无力症状较重的患者，在肌肉病理上脂质沉积的程度亦明显较重，支持肌纤维中脂质沉积的数量与临床症状有一定相关性的观点。本组有5例患者除大量脂滴沉积外，还发现伴有不同程度的肌纤维变性坏死，这种病理改变可能与患者病程进展的阶段和在肌纤维中的分布有关[15]。我们还对其中3例进行淋巴细胞亚群免疫组织化学染色，发现变性坏死肌纤维内只有CD68(+)的单核巨噬细胞浸润，而很少见到CD4(+)、CD8(+)和CD20(+)淋巴细胞。而且在肌内膜和肌间质内也未见有炎性细胞浸润，这些病理改变均不同于炎性肌病。有文献报道1例重症RR-LSM患者[16]，肌肉病理可见较多坏死肌纤维，免疫组化同样显示为CD68(+)，而MHC-1(-)，与我们的研究结果很相似。

近年来，由于二代测序技术在临床上的应用，基因检测已经成为遗传代谢性神经肌肉病病因诊断的重要方法。本组18例患者均检测到ETFDH基因突变，而未发现ETFA、ETFB基因突变，支持我国RR-LSM患者大多数为ETFDH基因突变所致的观点[3]。有文献报道RR-LSM患者ETFDH基因突变多为复合杂合突变，高达69%，且以错义突变多见[17]，在本组18例患者中15例(83.3%)为复合杂合突变，所占比例略高于文献报道。本组有2例为单一杂合突变，1例为移码突变(c.360dupT)，使所编码蛋白质自第121位氨基酸Pro开始发生移码，使蛋白质翻译提前终止。另1例为无义突变(c.1395T>G)，导致氨基酸改变p.(Tyr465*)，造成蛋白质翻译提前终止。一般对于常染色体隐性遗传病，如果两个等位基因存在不同的突变，则患者的临床表型往往由较温和的突变决定[18]，而且单一杂合突变通常不会致病，所以我们认为这两例患者可能还存在另一个等位基因的温和突变，只是目前未检测到该突变，考虑其突变位点可能位于非编码区或者等位基因出现不全失活。本组例8患者检测到1个新发的突变位点c.1115A>G，它可使ETFDH第372位的谷氨酰胺变为精氨酸，生物信息学软件提示该变异明显影响mRNA的剪接，判断其为可能致病性突变。该位点在千人基因组和dbSNP147等数据库均未见收录，应该是ETFDH基因新的突变位点。

ETFDH基因突变在我国南北方具有一定的地域性差异，奚报道的c.770A>G在北方和南方的发生频率分别为17.5%和10.6%，c.1454C>G在南方发生频率为6.1%，而北方57例患者中却未发现该突变[7]。在本组病例中发现c.770A>G(19.4%)和c.1454C>G(8.3%)两个位点发生突变的频率最高，同时也均高于上述文献报道，提示中原地区ETFDH基因可能存在不同于南北方的突变热点。本组患者均来自河南地区的各个地市，具有一定的代表性，所以我们认为c.770A>G和c.1454C>G，有可能是河南地区ETFDH基因的突变热点。但由于研究的样本量较小，有待于以后我们扩大病例数，更加全面地分析河南地区ETFDH基因的突变热点。

综上，ETFDH基因突变所致的RR-LSM患者临床表型多样，躯干中轴肌和咀嚼肌受累为其临床特点，肌肉病理发现肌纤维内有大量脂质沉积是诊断RR-LSM的重要依据。c.770A>G和c.1454C>G可能是河南地区ETFDH基因的突变热点，新发现的突变位点c.1115A>G，扩展了ETFDH基因的突变谱系。