基于多重PCR技术检测蜡样芽胞杆菌3种毒素基因方法的建立及评价

姜菲菲,李昊宇,贾慧建,王 丹,赵潇颖,王岳峰,周 童,孙丽媛

（1.北华大学医学技术学院分子生物教研室，吉林 吉林 132013；2.中国铁路沈阳局集团有限公司吉林疾病预防控制所，吉林 吉林 132001）

蜡样芽胞杆菌是一种兼性厌氧的革兰阳性杆菌，该菌属于芽胞杆菌科蜡样芽胞杆菌属，广泛存在于自然环境中，其可以产生内生孢子，对环境具有较强的适应性，能够抵抗高温、紫外线、电磁辐射和有害化学物质等不利条件［1］。携带有毒素基因的蜡样芽胞杆菌是引起食源性疾病的主要病原菌之一，近年来关于其污染情况的研究［2-3］较多。自然界中的微生物易污染食品，因蜡样芽胞杆菌而爆发的食物中毒也常有发生［4-6］。

蜡样芽胞杆菌属于人类正常菌群之一，只有携带毒素基因的菌株才能引起食物中毒［7］。蜡样芽胞杆菌能产生多种毒素，根据其引起食物中毒的症状可分为致呕吐型肠毒素和致腹泻型肠毒素，然而常规培养法只能检测出蜡样芽胞杆菌，不能证实蜡样芽胞杆菌是否产生毒素。蜡样芽胞杆菌编码相关毒素的毒力基因主要有肠毒素基因（entFM和bceT）、细 胞 毒 素 基 因（cytK）、溶 血 性 基 因（hblA、hblB、hblC和hblD）、非 溶 血 性 基 因（nhe）和呕吐毒素基因（ces）［8-9］。大部分蜡样芽胞杆菌均携带nhe、cytK和entFM 3种毒素基因，是一种携带复合型毒素的菌株［10］。研究［11］显示：意大利乳品厂加工干酪中蜡样芽胞杆菌毒素分析，所有分离株均检测到nhe、cytK和entFM 3种毒素基因；QU等［12］在中国某农场生菜上对于nhe毒素基因的检测高达100%；HAMMAD等［13］在埃及零售乳制品中检测出大量携带cytK毒素基因的蜡样芽胞杆菌，其能产生引起腹泻的细胞毒素，毒性较大且为蜡样芽胞杆菌所特有。nhe基因普遍存在于蜡样芽胞杆菌中，具有高流行性，是毒性的重要标志之一。蜡样芽胞杆菌除能引起上述食物中毒外，还能引起严重的非胃肠道感染，严重者可致患者死亡［14］。目前，对于蜡样芽胞杆菌致病毒素的检测方法主要包括免疫学方法、质谱分析法和分子生物学方法［15］，诊断形式单一，有关蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM 3种毒素基因同时检出的方法尚未见相关文献报道。因此本研究采用多重PCR技术建立nhe、cytK和entFM 3种毒素基因快速检测方法，为食品安全检查、污染控制和流行病学调查提供更为准确便捷的检测方法。

1 材料与方法

1.1 菌株、主要试剂和仪器蜡样芽胞杆菌标准菌株ATCC11778购自广东环凯微生物有限公司，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均为北华大学医学技术学院分子生物教研室保存菌种。100 bp DNA marker和2×Taq PCR Master Mix均购自北京天根生化科技有限公司，其他主要试剂均为国产分析纯试剂。TC9600-G多功能梯度PCR仪购自美国Labnet公司，JY300E通用型电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司，UV WHITE-2020D紫外凝胶成像分析仪购自美国BioRad公司，NanoDrop One微量核酸蛋白测定仪购自美国Thermo公司，YXQ-LS-75S11立式蒸汽灭菌器购自上海博讯实业有限公司，TGrinder OSE-Y50第3代变速组织研磨器套装购自北京天根生化科技有限公司，Thermo Fisher高速离心机购自上海赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 煮沸法提取DNA采用接种环挑取适量单个蜡样芽胞杆菌典型菌落于1.5 mL Eppendorf管中，100 μL ddH2O制备菌悬液，封口膜封闭离心管口并置于100℃金 属 浴10 min；12 000 g离 心10 min，吸取上清液，弃菌体沉淀，获得DNA溶液，微量核酸蛋白测定仪检测DNA浓度及纯度，－20℃冰箱内保存备用。

1.3 特异性引物设计在GenBank数据库中分别选取蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM毒素基因序列为靶基因序列，采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计相应种属特异性引物，目的基因片段间分别相差约100 bp，最大程度避免引物间错配，NCBI-Nucleotide BLAST软件分析引物预期PCR产物片段特异性。见表1。

表1 特异性引物序列Tab.1 Sequences of specific primers

1.4 PCR反应体系建立单重PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，10 mg·L－1引物F和R各0.5 μL，10 mg·L－1DNA模 板1 μL，无菌ddH2O补足至20 μL。PCR反应参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

多重PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 10 μ L，nhe499、cytK191和entFM363引 物 各0.5 μL，10 mg·L－1蜡样芽胞杆菌 毒 素 基 因DNA模 板1 μL，无菌ddH2O补足至20 μL。PCR反应参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个 循 环；72℃延 伸10 min，4℃保存。1.5 %琼脂糖凝胶，85 V电泳60 min，紫外凝胶成像分析仪观察结果。

1.5 PCR体系特异性评价采用煮沸法提取蜡样芽 胞 杆 菌DNA，ddH2O稀 释 至10 mg·L－1。单 重PCR体系特异性评价分别以nhe499、cytK191和entFM363为引物，蜡样芽胞杆菌DNA为模板，以金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌DNA为阴性对照，ddH2O作为空白对照，对单个引物PCR体系进行PCR扩增，证实单重PCR反应体系特异性。多重PCR反应体系特异性评价中依次减少体系中引物种类，每次减少1种，对多重PCR反应体系进行PCR扩增，ddH2O作为空白对照，证实多重PCR体系特异性。

1.6 多重PCR体系灵敏度评价标准菌株蜡样芽胞杆菌DNA模板经无菌ddH2O稀释，制备102～10－5mg·L－1梯度混悬液。PCR反应体系：DNA模板（102～10－5mg·L－1）1 μL，nhe499、cytK191和entFM363引物混合液3 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，无菌ddH2O 6 μL。PCR扩增，1.5 %琼脂糖凝胶电泳，采用紫外凝胶成像分析仪观察结果。

1.7 多重PCR体系稳定性评价采用多重PCR体系，分别于制备当日及每间隔6个月，提取其DNA，进行多重PCR体系稳定性检测，1.5%琼脂糖凝胶电泳进行验证，紫外凝胶成像分析仪观察结果。

2 结 果

2.1 蜡样芽胞杆菌基因组DNA提取采用微量核酸蛋白测定仪测定已成功提取的蜡样芽胞杆菌基因组DNA，蜡样芽胞杆菌纯度为1.50～1.60，质量浓度≥227 mg·L－1，满足多重PCR体系对DNA高纯度的要求，证实煮沸法可有效提取基因组DNA，不需其他耗材，操作简便，更节省时间。见表2。

表2 细菌基因组DNA纯度和浓度Tab.2 Purities and concentrations of genomic DNA of bacteria

2.2 PCR体系特异性nhe499、cytK191和entFM363引物依 次 出 现499、191和363 bp大小条带；条带清晰明亮，且无非特异性条带，表明nhe499、cytK191和entFM363引物具有良好特异性。1号泳道为多重PCR体系特异性试验结果，出现499、363和191 bp条带且3条条带清晰明亮；2、3和4号泳道为3重引物模板之间两两验证，依次出现目的基因2重条带；5、6和7号泳道表明多重PCR体系单一引物模板也依次出现目标条带，证实PCR体系中引物特异性良好，而且3对引物间互不干扰，无非特异性扩增。见图1。

图1 PCR体系引物特异性Fig.1 Specificities of primers of PCR system

2.3 多重PCR体系灵敏度多重PCR体系灵敏度试验PCR电泳结果，DNA模板浓度同时稀释至10－1mg·L－1时，仍可同时观察到3条特异性条带，证实多重PCR体系中引物具有良好灵敏度，最低检测限为10－1mg·L－1。见图2。

图2 多重PCR体系灵敏度Fig.2 Sensitivities of multiplex PCR system

2.4 多重PCR体系稳定性－20℃保存多重PCR体系12个月，期间每间隔6个月进行蜡样芽胞杆菌毒素基因检测，结果显示：不同时间多重PCR体系均能出现特异性条带，实验结果符合预期，证实多重PCR体系稳定性良好。见图3。

图3 各组PCR体系稳定性Fig.3 Stabilities of PCR systems in various groups

3 讨 论

携带毒力基因的蜡样芽胞杆菌是一种食源性致病菌，因此需要检测并准确分析环境和食品中蜡样芽胞杆菌是否含致病基因，以防止重大疫情的发生。目前，蜡样芽胞杆菌的检查方法依赖于培养法，金标准的传统培养和形态学鉴定检测结果时间长且阳性率低，因个人主观因素会造成误差，导致临床应用受限，且无法检测毒素基因的存在［16］。直接检测细菌毒素需要依靠高效液相色谱、高效液相色谱-串联质谱和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等设备［17］。张秀尧等［18］基于高效液相色谱技术快速检测食品中的蜡样芽胞杆菌呕吐毒素；董歆等［19］采用质谱法直接检测蛋白质组，并应用组织切片技术对感染蜡样芽胞杆菌后的组织进行分子水平分析，但此法需要更加精密的仪器设备。间接检测主要依靠免疫学实验和动物实验，但免疫学实验相对周期长、成本高，动物实验属半定性，不够准确且费用高［20］。

蜡样芽胞杆菌的毒力是多种多样的，所有致病菌株的共同标记毒素基因尚未见报道，因此蜡样芽胞杆菌的多重检测较为重要。多重PCR检测技术具有高效性、系统性和经济简便性等优势，其检测技术成本低、操作简便易行且执行快速，具有完备的检测装备［21-25］。刘变芳等［26］基于多重PCR技术检测生鲜肉中携带毒素基因的大肠埃希菌，快速简便且特异性强，能快速检出生鲜肉中的产毒素大肠埃希菌；薛云浩等［27］利用多重PCR技术检测由金黄色葡萄球菌肠毒素而引起的食物中毒，加强对卫生的管理；李慧等［28］基于多重PCR对农产品中的黄曲霉素进行快速检测。多重PCR技术的应用与蜡样芽胞杆菌致病毒素基因的快速检测将为检测人员提供更准确便捷的检测手段，可以作为蜡样芽胞杆菌检测较为理想的检测技术。

本研究采用煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA，提取效果优异；采用多重PCR技术检测蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM毒素基因，设计引物特异性高，与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均无PCR扩增；在同一反应体系中互不干扰，最低检测限同时可达10－1mg·L－1，灵敏度高，自制备起每6个月进行检测其稳定性一致。因此，多重PCR技术可用于蜡样芽胞杆菌的nhe、cytK和entFM毒素基因检测，本研究为食品监管提供了有效的检测手段。