二氢辣椒素不依赖诱导亚低温对心脏骤停复苏后脑损伤的防治作用及分子机制

钟晓芃， 郭 义， 张诗武

近年来心脏骤停(cardiac arrest, CA)患者生存率显著提高[1]。但这一部分患者多数遗留神经系统不可逆损伤及后遗症，造成巨大的社会及经济负担[2]。因此，心肺功能恢复不是心脏骤停患者复苏成功的唯一指标，脑复苏意义重大[3]。

二氢辣椒素(dihydrocapsaicin, DHC)是激活瞬时受体电位香草型1(transient receptor potential vanilla 1, TRPV1)受体的激动剂，包括笔者在内的多项研究[4-5]证明它对心脏骤停后的缺血-再灌注脑损伤有保护作用，并认为这种保护作用与诱导亚低温有关，然而我们前期的实验中发现这种保护作用并不完全依赖于诱导亚低温，但是机制并不完全清楚。为了证实二氢辣椒素不依赖诱导亚低温的脑保护作用及其分子机制，本研究设计了动物实验及细胞实验，揭示二氢辣椒素对心脏骤停复苏后缺血再灌注脑损伤的保护机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(年龄49～60天，体质量222～373 g)18只，由中国科学院放射学研究所动物中心提供，随机分配到三组：①假手术组(n=6)，只行气管插管，不诱导心脏骤停和进行心肺复苏(CPR); ②复苏组(n=6)，应用气管夹闭窒息法诱导心脏骤停后行常规CPR; ③辣椒素组(n=6)，在常规的CPR基础上腹腔注射二氢辣椒素。本研究经天津市人民医院实验动物管理委员会批准(编号：2021-SYDWLL-000175)。

1.2CPR SD大鼠造模前晚禁食不禁水，使用戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉。使用14号气管插管经口直视插入。左股动脉置入23号PE-50聚乙烯管，并使用SIEMENS Siredoc220多功能生理监测仪(Germany)监测心电图、血压及直肠温度。手术完成后，待大鼠生理参数稳定开始夹闭气管插管，观察大鼠呼吸、心搏和血压，心搏停止以动脉收缩压<20 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)作为心脏骤停标准。心脏骤停后开始进行CPR，胸外按压频率为200次/min，同步机械通气频率为100次/min，以胸廓前后径的1/3为按压深度标准，吸入100%浓度氧。2 min后，静脉注射肾上腺素0.025 mg/kg，CPR 10 min，如果出现室颤立即除颤，如心率血压恢复[恢复室上性心律，平均动脉压(MAP)>60 mm Hg，维持5 min以上]则停止按压，10 min后未恢复心率血压为复苏失败。复苏成功后1 h拔除所有插管，苏醒后放回笼中饲养，使用保温设备维持大鼠肛温在36.5 ℃左右。

1.3二氢辣椒素预处理 使用 1%DMSO溶解二氢辣椒素溶液，诱导心脏骤停前3 h腹腔注射0.2 mg/kg[6]。

1.4纸带移除实验[7]在进行实验的3 d前开始对大鼠进行训练。在复苏成功后72 h进行纸带移除实验，统计大鼠移除黏性胶带的时间，以180 s为观察终点，共统计3次取平均值。

1.5TUNEL法检测大脑皮层细胞凋亡 72 h后以断头法处死大鼠，取大鼠脑组织固定、包埋、切片，进行TUNEL检测。

1.6免疫组化法检测大脑皮层区TRPV1、PKA及 UCP-4表达 复苏成功后72 h断头处死大鼠，取大脑皮层组织切片、固定，加入山羊血清封闭液孵育1 h，兔抗鼠TRPV1抗体1∶1000，4 ℃过夜。次日切片用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗，加入山羊抗兔抗体(1∶100)，室温孵育1 h，充分清洗之后使用荧光显微镜观察摄片。

1.7Western blot检测大脑皮层区TRPV1、PKA及UCP-4蛋白表达 大鼠大脑皮层组织冰浴匀浆，4 ℃进行两次离心(12 000 r/min， 30 min)，蛋白定量之后电泳，转膜，封闭，加兔抗大鼠TRPV1、caspase-3及UCP-4单克隆抗体(1∶1000)，二抗为羊抗兔IgG，使用凝胶成像图像系统进行分析。

1.8脑组织活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)检测 测定0.5 g大脑皮层组织，置1.5 mL EP管中，加入1 mL PBS，匀浆，离心10 min(4000 r/min)，取上清液，根据试剂盒说明进行实验。

1.9细胞培养和分组 将生长情况良好的神经瘤母细胞(SH-SY5Y)放置于细胞培养箱(37 ℃，湿度饱和适宜，95%空气和5%CO2)中培养，细胞培养基组成为1%双抗、10%FBS和90%高糖DMEM。按照1∶3比例进行传代培养，3 d后把细胞分为五组。①对照组：细胞正常培养。②糖氧剥夺/复氧复糖组(OGD/R组)：将无糖的D.Hank′s液放入乏氧培养箱(5%CO2/95%N2) 30 min，使氧浓度<1%。使用无糖D.Hank′s液将细胞清洗4次，最终使葡萄糖浓度<1 mmol/L。把细胞放入厌氧罐内，自开始换液时开始计时至6 h，弃除无糖D.Hank′s液，更换为完全培养液，放入CO2培养箱继续孵育到24 h，用来模拟人体内神经细胞缺血-再灌注过程。③辣椒素组: 无糖培养基缺氧培养6 h，用PBS清洗，最后加入含二氢辣椒素(10 μmol/L)的培养基复糖复氧培养24 h。④辣椒平(capsazepine， CPZ)组：先加入辣椒平(10 μmol/L)处理1 h，再换无糖培养基缺氧培养6 h，用PBS清洗，最后加入含二氢辣椒素的完全培养基复氧复糖继续培养24 h。⑤H-89组：先加入PKA抑制剂H-89(100 μmol/L)处理1 h，再换无糖培养基缺氧培养6 h，用PBS清洗，最后加入含二氢辣椒素的完全培养基复氧复糖继续培养24 h。

1.10Western blot检测SH-SY5Y细胞相关蛋白 蛋白定量、电泳、转膜、封闭，一抗为兔抗大鼠单克隆抗体(1∶1000)，羊抗兔IgG为二抗，显色，凝胶成像图像分析。对照为抗β肌动蛋白抗体(β-actin)。

1.11流式细胞学检测SH-SY5Y细胞凋亡 将各组细胞收集到离心管内，1200 r/min 5 min离心，去上清，加PBS重悬；用PBS将细胞润洗2次，离心1200 r/min 5 min；流式细胞仪分析。

1.12流式细胞学检测SH-SY5Y细胞ROS荧光强度 将各组细胞收集到离心管内，用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞终止消化后收集，离心1200 r/min 5 min，去上清，加PBS重悬；将细胞润洗2次，离心1200 r/min 5 min；流式细胞仪分析检测细胞内DCFH-DA与ROS结合的荧光强度。

1.13流式细胞学检测SH-SY5Y细胞线粒体膜电位 将各组细胞收集，离心1200 r/min 5 min，弃上清，加入0.5 mL JC-1染色工作液，细胞培养箱中37 ℃孵育20 min；孵育结束时，离心5 min (1200 r/min)，细胞沉淀，弃上清液； 经JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次，重悬之后经流式细胞仪分析。

1.14流式细胞学检测SH-SY5Y细胞线粒体内钙荧光强度 根据说明书使用细胞线粒体提取试剂盒提取线粒体。经3次洗涤，用胰酶消化，6000 r/min离心5 min后收取细胞。加入台盼蓝染色液30 μL，在阳性比超过50%时停止匀浆。把细胞匀浆4 ℃，11 000 r/min离心10 min。沉淀即为分离得到的细胞线粒体，流式细胞仪上机检测，利用流式细胞仪测得Fluo-3与线粒体内Ca2+结合的荧光强度。

2 结果

2.1纸带移除实验 假手术组、复苏组及辣椒素组大鼠纸带移除时间分别为 (15±2)s、(143±31)s和(98±17)s，假手术组明显少于复苏组(P<0.0001)，辣椒素组明显少于复苏组(P<0.0046)。见图1。

注：*P<0.05图1 各组大鼠纸带移除时间

2.2大脑皮层神经元凋亡 尽管假手术组大鼠大脑皮层中有一些染色表明凋亡细胞，但辣椒素组和复苏组的染色程度更高。假手术组、复苏组和辣椒素组的染色积分光密度值(IOD值)反映了凋亡细胞的数量，分别为1755.21±64.11、2473.24±279.71和2010.31±95.31，假手术组明显少于复苏组(P<0.00001)，辣椒素组明显少于复苏组(P=0.001)。见图2。

2.3大脑皮层PKA表达

在假手术组中观察到PKA染色，但在辣椒素组中染色程度更高，染色的IOD值反映了PKA表达水平，假手术组、复苏组和辣椒素组分别为1711.13±51.35、2012.24±75.54和2451.41±87.21，辣椒素组明显高于复苏组(P<0.001)。见图2。

假手术组、复苏组和辣椒素组相对PKA含量分别为0.435±0.021、0.413±0.032和0.631±0.041，辣椒素组明显低于复苏组(P<0.0004)，假手术组与复苏组比较差异无统计学意义(P=0.0699)。见图3。

2.4大脑皮层UCP-4表达

在假手术组中观察到UCP-4染色，但在复苏组和辣椒素组中染色程度更高，染色的IOD值反映了UCP-4表达水平，假手术组、复苏组和辣椒素组分别为1538.13±59.82、2011.41±103.22和2421.24±209.76，假手术组明显低于复苏组(P<0.001)，复苏组明显低于辣椒素组(P=0.0004)。 见图2。

假手术组、复苏组和辣椒素组相对UCP-4含量分别为0.3960±0.0410、0.3351±0.0490和0.601±0.0870，假手术组与复苏组比较差异无统计学意义(P=0.4970)， 辣椒素组明显高于复苏组(P=0.0047)。见图3。

2.5大脑皮层TRPV1表达

假手术组、复苏组切片的TRPV1染色强度低，而辣椒素组切片的TRPV1染色强度高。反映TRPV1表达的染色IOD值在假手术组、复苏组和辣椒素组中分别为1523.12±82.23、1587.77±77.24和2301.12±61.23，辣椒素组明显高于复苏组(P<0.0001)及假手术组(P<0.0001)。见图2。

注：TRPV1为瞬时受体电位香草型1；*P<0.05图2 各组大鼠大脑皮层神经元凋亡及PKA、UCP-4、TRPV-1表达

注：TRPV1为瞬时受体电位香草型1；*P<0.05图3 各组大鼠大脑皮层相对TRPV1、UCP-4、PKA含量

假手术组、复苏组和辣椒素组相对TRPV1含量分别为0.440±0.038、0.478±0.049和0.801±0.043，辣椒素组明显高于复苏组(P=0.0002)及假手术组(P=0.0020)。见图3。

2.6大脑皮层组织ROS 假手术组、复苏组和辣椒素组ROS含量分别为(18.2±2.0)pg/mg、(47.6±2.7)pg/mg和(35.64±2.2)pg/mg，复苏组明显高于假手术组(P<0.0001)及辣椒素组(P<0.0001)。见图4。

注：ROS为活性氧簇；*P<0.05图4 各组大鼠大脑皮层组织ROS含量

2.7二氢辣椒素对OGD/R条件下SH-SY5Y细胞TRPV1、PKA的影响

Western blot结果显示，对照组、OGD/R组、辣椒素组、辣椒平组及H89组相对PKA蛋白含量为0.671±0.021、0.235±0.034、0.540±0.042、0.354±0.013、0.337±0.025。与对照组比较，OGD/R组SH-SY5Y细胞PKA表达明显降低(P<0.0001)；与OGD/R组比较，辣椒素组SH-SY5Y细胞PKA表达明显升高(P<0.0001)；与辣椒素组比较，H89组、辣椒平组SH-SY5Y细胞PKA表达明显降低(P=0.0025、0.0047)；H89组、辣椒平组相似(P>0.9901)。

对照组、OGD/R组、辣椒素组、辣椒平组及H89组相对TRPV1蛋白含量分别为0.157±0.011、0.164±0.033、0.592±0.039、0.312±0.024、0.361±0.031。与对照组比较，辣椒素组SH-SY5Y细胞TRPV1表达明显升高(P<0.00001)；与OGD/R组比较，辣椒素组SH-SY5Y细胞TRPV1表达明显升高(P<0.0001)；与辣椒素组比较，H89组、辣椒平组SH-SY5Y细胞TRPV1表达明显降低(P=0.0004、0.0001)；H89组、辣椒平组相似(P>0.6371)。见图5。

注：TRPV1为瞬时受体电位香草型1；OGD/R为糖氧剥夺/复氧复糖；*P<0.05图5 各组大鼠SH-SY5Y细胞UCP-4、caspase-3、PKA、TRPV1表达

2.8二氢辣椒素通过激活TRPV1/PKA信号途径对OGD/R条件下SH-SY5Y细胞UCP-4的影响 Western blot结果显示，对照组、OGD/R组、辣椒素组、辣椒平组及H89组相对UCP-4表达分别为0.197±0.022、0.213±0.043、0.517±0.048、0.344±0.026、0.381±0.027。与对照组、OGD/R组比较，辣椒素组SH-SY5Y细胞UCP-4表达升高(P<0.0001)；与辣椒素组比较，H89组、辣椒平组SH-SY5Y细胞UCP-4表达明显降低(P=0.0023、0.0003)；H89组、辣椒平组相似。与对照组(11.226±0.911)比较，其余各组JC-1探针红绿色荧光强度比明显减小，OGD/R组(0.988±0.002，P<0.001)，辣椒素组(5.104±0.001，P<0.001)，辣椒平组(2.034±0.011,P<0.001)，H89组(1.445±0.009,P<0.001)；与辣椒素组比较，OGD/R组、辣椒平组及H89组红绿色荧光强度比明显减小(P<0.001、=0.075、=0.021)。见图6。

2.9二氢辣椒素通过激活TRPV1/PKA信号途径抑制OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞线粒体Ca2+超载 流式细胞结果发现，与对照组比较，其余四组线粒体内钙离子荧光强度增强，其中OGD/R组(P=0.0002),辣椒素组(P=0.0272),辣椒平组(P=0.0035),H89组(P=0.0153)；与辣椒素组比较，OGD/R组、辣椒平组及H89组线粒体内钙离子荧光强度明显增强(P=0.0082、0.0043、0.0010)。见图6。

2.10二氢辣椒素通过激活TRPV1/PKA信号途径抑制OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激因子产生 流式细胞结果发现，与对照组比较，OGD/R组ROS荧光强度明显增强(P<0.0001)；与OGD/R组比较，辣椒素组ROS荧光强度明显减小(P<0.001)；与辣椒素组比较，辣椒平组、H89组ROS荧光强度明显增强(P<0.001、=0.001)。见图6。

2.11二氢辣椒素通过激活TRPV1/PKA信号途径抑制OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞caspase-3蛋白表达 Western blot结果显示，对照组、OGD/R组、辣椒素组、辣椒平组及H89组相对caspase-3表达分别为0.162±0.013、0.669±0.023、0.299±0.038、0.518±0.046、0.516±0.041。与辣椒素组比较，OGD/R组、H89组、辣椒平组SH-SY5Y细胞caspase-3表达明显升高(P=0.0004、0.0199、0.0190)；与对照组比较，辣椒素组SH-SY5Y细胞caspase-3表达差异无统计学意义(P=0.182)。见图5。

2.12二氢辣椒素通过激活TRPV1/PKA信号途径抑制OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞凋亡 流式细胞结果显示，与对照组比较，OGD/R组SH-SY5Y细胞凋亡率明显升高(P=0.0102)；与辣椒素组比较，OGD/R组、辣椒平组、H89组SH-SY5Y细胞凋亡率明显升高(P=0.0279、0.0271、0.0150)。见图6。

注：OGD/R为糖氧剥夺/复氧复糖；ROS为活性氧簇；*P<0.05图6 各组大鼠SH-SY5Y细胞凋亡、线粒体膜电位、ROS和钙离子荧光强度

3 讨论

Fosgerau等[8]研究发现，二氢辣椒素可以激活TRPV1受体引起实验动物的亚低温。随后的研究集中于二氢辣椒素诱导亚低温治疗心脏骤停复苏后脑损伤[4-5]及缺血性中风脑损伤[6,9-10]，这些研究者认为这种保护作用是因为亚低温的作用。而本实验使用加温设备使各组实验动物保持相同的体温，细胞实验更是很好地消除了温度的影响，而二氢辣椒素对心脏骤停、氧糖剥夺/复糖复氧的中枢神经细胞均有保护作用，结果有统计学意义。

有研究显示，神经细胞在缺血-再灌注时，因为组织氧灌注恢复，引起激烈的线粒体氧化应激反应，线粒体ROS及活性氮簇(RNS)生成增加[11]。过度的线粒体氧化应激将引起线粒体功能障碍，表现为线粒体膜电位降低，线粒体内出现钙超载[12-13]。本实验发现，OGD/R可导致SH-SY5Y细胞线粒体内钙离子浓度增加，ROS生成增加，线粒体膜电位降低，给予二氢辣椒素预处理后，可减少OGD/R损伤下ROS的生成，提高线粒体膜电位，减少线粒体内钙离子浓度，提示二氢辣椒素可减轻OGD/R诱导的线粒体氧化应激，保护线粒体功能。

已知大脑皮层和海马都含有大量的UCP-4。UCP-4激活可以调节神经元能量生成，达到神经保护和脑细胞氧化应激调节的作用[14]。当大脑神经细胞处于氧化应激时，UCP-4可通过降低ROS 生成而起到抗氧化作用，减少细胞凋亡[15-16]。二氢辣椒素预处理可使UCP-4过表达，caspase-3蛋白表达降低，SH-SY5Y细胞的凋亡细胞数量减少，由此推测UCP-4可能也参与了缺血再灌注损伤导致的SH-SY5Y细胞凋亡。

据文献报道，提高大鼠海马组织cAMP含量，可以促进PKA磷酸化，活化cAMP-PKA信号通路，从而保护海马神经元[17]；如果减低PKA蛋白磷酸化水平，会导致海马神经细胞凋亡[18-19]。本实验发现，氧糖剥夺6 h再复氧复糖24 h后，SH-SY5Y细胞PKA表达和对照组比较有所降低，说明氧糖剥夺再复糖复氧可以抑制PKA表达；二氢辣椒素预处理后，PKA表达增加，且UCP-4表达增加，凋亡细胞减少；同时使用二氢辣椒素抑制剂辣椒平抑制TRPV1表达和应用PKA抑制剂H89抑制PKA 表达，则 UCP-4表达降低，凋亡细胞增加。

本实验发现，心脏骤停前3 h应用二氢辣椒素预处理可改善心脏骤停后大鼠的神经功能,同时TUNEL分析显示，与对照组比较,二氢辣椒素预处理组实验动物大脑皮层神经细胞凋亡得到改善。进一步的组织学检查及Western检查也证实了大脑皮层增加了PKA和UCP-4表达,同时ROS含量减少,从而减少了缺血-再灌注的氧化应激损伤。

综上所述，二氢辣椒素激活TRPV1受体可通过cAMP/PKA信号通路，增加线粒体解偶联蛋白表达，提高被缺血再灌注损伤降低的线粒体膜电位,减少ROS的产生,抑制凋亡因子释放,从而减少缺血再灌注损伤导致的神经元细胞凋亡。