吉西他滨联合放射对人胰腺癌CFPAC-1细胞株裸鼠移植瘤EphB4、Caspase3表达的影响

李芬芬 季 斌

外科手术切除被认为唯一治愈可能，手术切除后5年生存率仍然很低，在15%～30%[6-8]，可能提示早期胰腺癌患者在最初诊断时不能单纯从手术中获益，可能与术前影像学检查中看不到的微转移有关。在二十多年的时间里，单一吉西他滨(GEM)是唯一被批准并广泛使用的药物[9]。与5-氟尿嘧啶(5-FU)相比，吉西他滨治疗患者的中位总生存率(5.65 vs 4.41个月)和1年生存率(18% vs 2%)显著改善[10]。回顾性数据表明，对于无法切除的局部晚期胰腺癌，增加放疗剂量提高生存率。

Caspases通常在细胞凋亡的早期阶段被激活[11]。Caspase-3被称为家族的主要刽子手，通过裂解细胞底物，在细胞凋亡死亡中发挥重要作用[12]。caspase-3的表达水平是一种已知的评估诱导凋亡机制的方法[13]。EphB4通过其相应的配体EphrinB2激活，控制细胞与细胞之间的相互作用、血管生成、肿瘤生长和转移[14-15]。有报道称，高表达EphB4可促进胰腺癌、结肠直肠癌和甲状腺乳头状癌的生长和迁移，而这种作用可通过下调EphB4逆转，使EphB4成为癌症治疗的一个有希望的靶点[16-18]。

1 材料与方法

1.1 材料

吉西他滨粉剂、MTT试剂盒购自江苏豪森药业股份有限公司。mRNA分析试剂焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)、Trizol总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司；SYBR试剂盒由瑞士Roche公司提供。兔抗人EphB4,Caspase3一抗均购自英国Abcam公司。直线加速器购自美国瓦里安公司。实验动物：BALB/c-nu/nu裸小鼠36只，4～5周龄，雄性，18～20 g，由中国科学院上海实验动物中心提供，无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级。

1.2 细胞株及其培养

人胰腺癌CFPAC-1细胞株由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，使用含有10%胎牛血清、IMDM培养基细胞培养。细胞株呈贴壁上皮细胞，待细胞融合度>70%时，进行清洗、消化、传代。取对数生长期的细胞为实验所用。

1.3 MTT法检测人胰腺癌CFPAC-1细胞增殖

将CFPAC-1细胞约为1×104/ml，每组设置4个复孔，每孔100 μl细胞悬液接种于96孔培养板，培养到细胞单层铺满孔底。加药组：对照组、1 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml、10 μg/ml吉西他滨加入后细胞培养24 h、48 h；放射组：细胞置于直线加速器6MV-X线下，照射线剂量分为0 Gy，2 Gy，4 Gy，6 Gy，8 Gy，以400 cGy/min的速率不同照射剂量照射后，细胞培养24 h、48 h。筛选出最佳的放射剂量后，加入吉西他滨各剂量组24 h后，细胞培养48 h。得出最佳放射剂量后，加入吉西他滨各个剂量组，细胞培养48 h。待三个96孔板实验孔每孔加入5 g/l的MTT20 μl溶液，避光继续培育4 h后加入150 μl DMSO后平板摇床摇10 min，结晶物充分溶解，在酶标仪上测550吸光值值，实验重复三次。绘制药物剂量-抑制率曲线图后，计算IC50值，细胞增殖存活率=(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。

1.4 人胰腺癌CFPAC-1细胞株裸小鼠移植瘤建模及分组

在无菌空气层流室内，裸小鼠先饲养适应7天。PBS把细胞制成单细胞悬液，用台盼蓝拒染法计数活细胞在95%以上，细胞浓度调为 1×107/ml，36只BALB/c-nu/nu裸小鼠每只左下肢外侧偏背部接种0.2 ml(2×106个细胞)，约5～8 d成瘤，待肿瘤长到大小约1 cm时进行干预。36只裸小鼠全部成瘤，随机分为6组：A组：生理盐水腹腔注射(按鼠重计算)；B组：单次照射15 Gy；C组：腹腔注射吉西他滨25 mg/kg；D组：腹腔注射吉西他滨50 mg/kg；E组：腹腔注射吉西他滨25 mg/kg，24 h后单次照射15 Gy；F组：腹腔注射吉西他滨50 mg/kg，24 h后单次照射15 Gy。照射方法：每次1只裸小鼠，四肢固定，采用直线加速器6MV-X线15 Gy照射，只把左下肢外侧偏背侧肿瘤置于放射野中，瘤体上放置1.5 cm湿纱布，其它部位用铅橡皮遮蔽。

1.5 人胰腺癌CFPAC-1细胞株裸小鼠移植瘤体积、体重测量及标本处理

六组进行细胞种植后，于第1、5、11、17、23、28天测量每只裸鼠的体重及瘤体积变化情况，使用游标卡尺来测量肿瘤的长径(a)、短径(b)，肿瘤体积(V)的计算公式：V=a×b2/2。共观察28天，观察结束后处死裸鼠，立即剔除其他组织，剥离取出瘤块称重。肿瘤抑制率=(对照组平均肿瘤重量-实验组平均肿瘤重量)/对照组平均肿瘤重量×100%。

1.6 RT-PCR检测组织中EphB4、Caspase3基因表达

用Trizon试剂提取组织总RNA并检测总RNA的浓度及纯度。首先取500 ng总RNA与1 μl引物、无核酸酶的高纯水混合至12 μl ，65 ℃ 5 min，将下列组分按照顺序加入以上混合液中5X反应缓冲液4 μl、RiboLockTMRNA酶抑制剂1 μl、10 mM dNTP Mix 2 μl、RevertAidTMM-MuLV 逆转录酶1 μl，总体积20 μl，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，第一链cDNA合成；DNA为模板进行RT-PCR并以GAPDH进行扩增，引物设计运用Primer Premier 5.0软件进行，见表1。

初中函数是初中阶段教学的重点难点。初中函数是一个全新的概念，函数的学习与数列、排列组合、方程、不等式等知识点都有着重要的联系，初中数学普遍存在脱离现实生活、教学方法单一的特点，以至于学生学习函数时兴趣不高，课堂氛围不够活跃。教师在函数教学过程中会遇到很多难题，以及函数对逻辑思维能力要求比较高，影响了初中数学函数教学的质量。因此，初中教师应积极丰富初中函数的教学方式，改变传统的教学模式，培养学生的函数解题思维，重视函数的实际应用，摆脱初中数学函数教学的困境，提升初中阶段函数教学的质量。

表1 EphB4、Caspase3、GAPDH引物序列

将FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)10 μl 、forward primer(5 μM)1.2 μl、reverse primer(5 μM)1.2 μl、ddH2O 6.6 μl，总体积20 μl混匀后加入2 μl模板DNA；PCR反应条件：50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min、95 ℃15 s(或10 s)40 cycles，58 ℃～60 ℃ 60 s(或30 s)，开始运行程序。

1.7 裸小鼠移植瘤组织HE染色

取肿瘤组织块固定之后石蜡包埋，5 μm切片。低浓度至高浓度酒精脱水-二甲苯中透明-苏木精染色5 min，自来水冲洗1 h，盐酸乙醇分化30 s，自来水浸泡15 min，伊红液2 min，脱水透明，中性树脂封固。

1.8 免疫组化检测裸小鼠移植瘤中EphB4、Caspase3蛋白表达的变化

玻片处理，修组织块，包埋组织，切片，捞组织，脱蜡，柠檬酸缓冲液修复抗原，血清封闭，滴加一抗(多克隆抗体EphB4,Caspase3工作浓度为1∶150)，加二抗，加碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，生物素复合物，加显色剂，苏木精复染，脱水，封片。阴性对照是用PBS缓冲液来代替一抗。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 吉西他滨、放射、联合组处理对裸小鼠皮下移植瘤的影响

对照组(A组)、放射组(B组)、用药组(C组、D组)、联合组(E组、F组)六组干预后观察28 天后裸小鼠未发生死亡，大体形态学观察六组裸小鼠外观上有较大的差异，其中对照组裸小鼠最早出现行动不便、意识迟缓、体型消瘦等现象。移植瘤切面观呈白色、质脆，六组移植瘤体重大体观呈肿瘤结节簇生。与A组相比较， C组、D组肿瘤体积和重量明显降低(P<0.01)，并且C组、D组之间有差异(P<0.05)；E组、F组比B组的肿瘤体积和重量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，并且E组、F组两组间有差异(P<0.05)；E组、F组比B组、C组和D组肿瘤的体积和重量明显下降(P<0.05)；见表2。六组的抑瘤率(表3)，F组裸小鼠的皮下移植瘤的体积最小、肿瘤重量最轻，抑瘤率最高。

表2 各组裸小鼠皮下移植瘤体积

表3 各组裸小鼠瘤重量和抑瘤率(n=6)

2.2 人胰腺癌CFPAC-1细胞株增殖活力的测定(MTT)

单纯吉西他滨两组、单纯放射两组对人胰腺癌CFPAC-1细胞株生长有明显抑制作用，呈剂量、时间依赖的趋势。随着吉西他滨浓度的升高、放射剂量的增加、作用时间的延长，细胞存活率逐渐降低，表明细胞的生长抑制作用逐渐增强；得出6MV-X线直线加速器照射8 Gy放射剂量为最佳放射剂量，在不同剂量吉西他滨下培养细胞24 h后6MV-X线直线加速器照射8 Gy放射剂量后对细胞有比单纯用药组、单纯放射组更为明显的抑制作用，呈剂量依赖的趋势，细胞存活率逐渐降低更明显。

2.3 EphB4基因、Caspase3基因在人胰腺癌细胞株CFPAC-1裸鼠移植瘤中的表达

EphB4受体、Caspase3受体mRNA在六组肿瘤组织中均有表达。与对照组相比较，EphB4受体在单纯用药组表达明显降低(P<0.05)，并且联合组表达最低(P<0.01)；C组、D组两组比较有明显下降(P<0.05)；E组、F组两组比较有明显下降，并且比B组显著下降(P<0.05)。Caspase3基因表达与EphB4基因相反。

2.4 EphB4受体、Caspase3受体在人胰腺癌细胞株CFPAC-1裸鼠移植瘤的表达

EphB4、Caspase3抗体的阳性染色主要分别位于细胞膜和细胞质内，呈棕褐染色，阴性、阳性的表达根据细胞染色的强度以及染色细胞所占的面积这两者积分之和来判断。染色强度积分判断：无染色为0分，轻度染色为l分，中度染色为2分，强染色为3分；染色面积积分判断：无细胞染色为0分，<25%细胞染色为l分，25%～50%细胞染色为2分，>50%细胞染色为3分。胰腺癌细胞的染色强度及染色面积两者积分相加，依次为：(-)：0；(+)：l～2；(++)：3～4；(+++)：5～6；两者积分之和>2为表达阳性，≤2为表达阴性。组织切片于400倍光镜下随机选取10个视野，同一条件下拍照摄片。EphB4蛋白染色：与A组相比，C组、D组明显降低(P<0.05)，E组、F组降低最为明显(P<0.01)； E组、F组与B组、C组、D组相比，表达明显降低(P<0.05)，F组表达为最低。Caspase-3蛋白染色：与EphB4蛋白相反。

3 讨论

胰腺癌是美国第四大癌症死亡原因，5年生存率为3%[19]。GLOBALCAN数据库显示胰腺癌是全球男性和女性第7死亡原因[20]，预计在欧盟国家胰腺癌超过乳腺癌成为第3死亡原因[21]。可切除胰腺导管腺癌(PDAC)目前的治疗标准是先手术后辅助化疗[22]。然而，由于缺乏适当的早期检测和筛查方法，大多数胰腺癌患者被诊断为晚期或转移性疾病。只有15%～20%的胰腺癌患者在确诊时接受手术治疗，即使是已经接受手术切除的患者，因为大多数患者会在一年内出现疾病复发[23]。这些令人沮丧的结果的根本原因与辅助手术治疗的不良疗效、未检测到的微转移和化学耐药性的发展有关。即使是R0切除患者的5年生存率仍然很低，约为20%。胰腺癌是一种全身性疾病，因为即使是早期疾病的大多数患者最终也会发展为转移。尽管吉西他滨具有一定的抗肿瘤活性并提高辅助治疗的生存率，但迄今为止，大多数胰腺癌患者的治疗重点仍然是姑息性的。

凋亡是一种程序性细胞死亡，对于维持体内生长、发育和稳态至关重要[24]。

不管凋亡是如何启动的，一个半胱氨酸导向的蛋白酶家族，即caspases，会从非活性的酶原样状态被系统激活，并在成熟后，针对大量的细胞蛋白进行水解。由于其活性的性质，Caspases是高度调控的蛋白，因为不适当的活化会产生毁灭性的影响。凋亡caspases一般分为“启动子”和“刽子手”。caspases的关键生物学功能与凋亡和程序性死亡有关[25-26]，也与非细胞死亡功能的炎症、树突、细胞分化和迁移中有关[27]，分为两个不同的途径[28]。Caspase-3通过结构蛋白的切割导致核包膜的破坏和基因组DNA的破坏。低水平的caspase-3活性对几种细胞的关键发育过程是必要的[29]。

增殖信号的持续刺激和相关监测机制的失调是肿瘤形成的重要原因。生长因子可以激活生长因子受体，产生细胞内级联信号，调节肿瘤细胞的增殖。EphB4是受体酪氨酸激酶家族的重要成员，在各种癌症中过表达并促进肿瘤生长和迁移[30-31,17]。EphB4在正常和恶性细胞中都有促进细胞迁移潜能的报道[32]。

本实验通过构建人胰腺癌裸小鼠移植瘤模型来观察在无干预(A组)、干预组(B组、C组、D组、E组、F组)情况下生存28天后，在宏观上，观察长径、短径以及瘤重的变化，并从微观上荧光定量PCR检测组织中EphB4、Caspase3基因表达、免疫组织化学染色法观察EphB4、Caspase3蛋白形态的变化，论证一定剂量的吉西他滨对局部胰腺癌具有放射治疗的效果。

本实验结果初步显示，25 mg/kg吉西他滨+放射联合组、50 mg/kg吉西他滨+放射联合组的肿瘤体积、重量明显小于其它组，而且50 mg/kg吉西他滨+放射联合组的抑瘤率最高；在微观上观察干预组的(B组、C组、D组、E组、F组)EphB4、Caspase3的表达较对照组(A组)明显增加，联合组表达(E组，F组)强于其它单纯放射组(B组)和用药组(C组、D组)，F组的表达最强，各干预组之间具有显著的差异。实验结果表明一定剂量的吉西他滨用药对于放射有增敏疗效，对局部放射治疗有明显效果，为指导胰腺癌的治疗提供了科学依据。

尽管胰腺癌的治疗已经取得了进展，但吉西他滨仍然是晚期PDAC新辅助、辅助和姑息治疗的基础。为了获得有效的治疗方案，临床医生主要依靠平衡抗肿瘤作用和对正常组织的毒性。吉西他滨分子的许多化学修饰和封装设计的已经提出克服耐药性机制。通常，保护胺功能(4-(N)位)的前药物会阻断cda诱导的吉西他滨失活，而将吉西他滨包封到脂质体和NPs等胶体系统中，可以改善其药代动力学特征，从而改善生物分布和位点特异性给药。