女性尖锐湿疣患者T淋巴细胞亚群表达及复发观察

黄永初，张小超，朱小美

（华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科，武汉 430000）

尖锐湿疣是由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起的表皮良性增生性疾病，主要通过性接触、母婴等途径传播，在欧美国家发病率仅次于淋病，在我国发病率逐年升高[1]。目前临床发现的HPV病毒有100多个亚型，其中30多种具有致病性，根据病毒的致病性又可分为高危型与低危型，不同亚型的HPV引起的尖锐湿疣形态、预后不尽相同[2]。HPV感染机体后很少进入血液，几乎不会发生抗原递呈，导致机体不能完全将HPV彻底清除，增加了尖锐湿疣的复发风险，成为尖锐湿疣临床治疗的难点。因此，寻找一种低复发的治疗方案是临床研究的重点。近年来，研究[3]发现，尖锐湿疣患者有明显的Th1/Th2免疫失衡，且免疫失衡与患者复发有关。研究[4]指出，肛门直肠尖锐湿疣的复发与HPV感染亚型有显著的相关性。但目前国内关于治疗后复发的女性尖锐湿疣患者HPV感染亚型与T淋巴细胞亚群的关系研究较少。鉴于此，本研究就女性尖锐湿疣患者HPV感染亚型、T淋巴细胞亚群表达的差异及二者之间的关系进行分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

对华中科技大学同济医学院附属同济医院收治的162例女性尖锐湿疣患者进行回顾性病例对照研究，将其中81例治疗后复发的患者纳入复发组，81例治疗后未复发患者纳入未复发组。纳入标准：1）尖锐湿疣符合《皮肤性病学》[5]中诊断标准：根据患者病史、典型表现，结合醋酸白试验、HPV及组织病理检查明确诊断；2）患者均依据《尖锐湿疣治疗专家共识（2017）》[6]接受规范治疗；3）临床资料完善。排除标准：1）合并其他性传播疾病，如淋病、梅毒等；2）合并其他皮肤疾病，如疱疹、湿疹、皮炎等；3）患有过敏性疾病或自身免疫性疾病；4）患有严重肝肾功能、心肺功能异常；5）合并结核、病毒性肝炎等其他传染性疾病；6）HPV混合感染；7）近期内使用过免疫调节剂。本研究符合《赫尔辛基宣言》中伦理要求。

1.2 方法

1.2.1 基线资料收集 查阅患者病历资料，采用描述性研究记录患者的年龄、吸烟史、大量饮酒史（每日饮酒超过20 g，或2周内饮酒超过40 g）、性伴侣数、安全套使用情况（有、无或偶尔使用）、皮损数量、感染部位（阴唇、尿道口、宫颈）、生殖系统感染情况。

1.2.2 HPV检测方法 治疗前使用洗脱管收集患者皮损组织并捣碎漂洗，离心分离10 min，转速13 000 r·min-1，留取管底细胞，加入裂解液50 μL，加热10 min（100℃水浴），再次离心（13 000 r·min-1，10 min），留取上清液；采用聚合酶链式反应进行扩增后，加入0.1%十二烷基硫酸钠、柠檬酸钠混合液5 mL，水浴加热10 min，杂交1 h（51℃）；最后进行洗膜、显色；判定HPV感染亚型。结果判定：根据洗膜条中蓝色斑点显色的位置判定，包括高危型：HPV16、18、31、33、45、52、56、59；低危型：HPV6、11、42、43、44。

1.2.3 T淋巴细胞亚群检测方法 治疗前采集患者外周血5 mL，离心10 min，转速3 500 r·min-1，弃上清液，用磷酸盐缓冲液清洗2次，加入70%冷乙醇固定细胞过夜保存（-20 ℃）；再次离心（3 500 r·min-1，10 min）并加入核糖核酸酶、碘化丙啶染液，避光孵育30 min（4 ℃），保证每个样本获取2×104细胞数；使用流式细胞仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号BriCyte E6）测定CD3+、CD4+、CD8+，计算每1万个细胞中CD3+、CD4+、CD8+的百分比。正常参考值：CD3+：61% ～ 85%，CD4+：28% ～ 58%，CD8+：19%～48%，CD4+/CD8+：0.9～2.0。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件处理数据，用Shapiro-Wilk正态分布检验计量资料正态性，均数±标准差（±s）表示符合正态分布计量资料，组间比较行独立样本t检验；例（%）表示计数资料，用χ2检验；采用Kendall’s tau-b相关性分析检验女性尖锐湿疣患者HPV感染亚型与T淋巴细胞亚群表达的相关性；采用Logistic回归分析检验HPV感染亚型、T淋巴细胞亚群对尖锐湿疣复发的影响；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复发组与未复发组患者基线资料比较

复发组大量饮酒史、合并泌尿系统感染占比高于未复发组，使用安全套占比低于未复发组，差异有统计学意义（P＜0.05）见表1。

表1 复发组与未复发组患者基线资料比较 （n= 81）例（%）

2.2 女性尖锐湿疣患者HPV亚型分布情况

162例女性尖锐湿疣患者高危型HPV亚型75例，低危型HPV亚型87例；复发组高危型HPV感染占比（62.96%，51/81）高于未复发组（29.63%，24/81），差异有统计学意义（χ2=18.099，P= 0.001）。见表2。

表2 女性尖锐湿疣患者HPV感染亚型分布 例（%）

2.3 不同HPV感染亚型女性尖锐湿疣患者T淋巴细胞亚群表达

HPV感染高危型患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平低于低危型，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同HPV感染亚型CD8+比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 不同HPV感染亚型患者T淋巴细胞亚群表达（±s）

表3 不同HPV感染亚型患者T淋巴细胞亚群表达（±s）

注：与高危型比较，# P＜0.05，### P＜0.001

项目 例数 CD3+/% CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+高危型 75 73.32±10.00 41.98±6.76 33.60±11.75 1.37±0.45低危型 87 76.90±8.94# 46.89±6.46### 33.13±15.32 1.58±0.45#

2.4 女性尖锐湿疣患者HPV感染亚型与T淋巴细胞亚群表达的相关性分析

经Kendall’s tau-b相关性分析检验，女性尖锐湿疣患者HPV感染亚型与CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+水平呈负相关（r= -0.162、-0.330、-0.207，P＜0.05）。

2.5 复发组与未复发组患者T淋巴细胞亚群表达

复发组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+低于未复发组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 复发组与未复发组患者T淋巴细胞亚群表达（±s，n= 81）

表4 复发组与未复发组患者T淋巴细胞亚群表达（±s，n= 81）

注：与复发组比较，### P＜0.001

项目 CD3+/% CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+复发组 72.56±9.64 42.42±6.20 35.12±11.21 1.30±0.37未复发组 77.92±8.80### 46.82±7.15### 31.58±15.76 1.66±0.48###

2.6 HPV感染亚型与T淋巴细胞亚群影响尖锐湿疣复发的回归分析

将尖锐湿疣复发作为因变量（1 =复发，0 =未复发），将HPV感染亚型与CD3+、CD4+、CD4+/CD8+作为自变量（HPV感染亚型为分类变量，1=高危型，0 =低危型；CD3+、CD4+、CD4+/CD8+为连续变量），经Logistics回归分析，结果显示HPV感染高危型是尖锐湿疣复发的危险因素（OR＞1，P＜0.05），CD3+、CD4+、CD4+/CD8+高是尖锐湿疣复发的保护因素（OR＜1，P＜0.05）。见表5。

表5 HPV感染亚型与T淋巴细胞亚群影响尖锐湿疣复发的回归分析

3 讨论

HPV感染是引起尖锐湿疣的病原学原因。由于尖锐湿疣的发病部位较为特殊，女性患者，就医、治疗均等受到一定限制，给女性患者身心健康造成严重影响[7]。目前，尖锐湿疣没有公认的治疗方案，主要根据患者病情制定综合防治措施[8]。多数患者经治疗后皮损可消退或改善，HPV感染减少，但并没有有效的手段彻底根除HPV感染，部分患者治疗后仍会复发。

尖锐湿疣的复发与多种因素有关，如大量饮酒、安全套使用、生殖系统感染等。大量饮酒不仅会降低机体的免疫功能，引起DAN修饰对宫颈上皮造成损伤，也会对中枢神经产生一过性的抑制作用，导致尖锐湿疣的复发[9]。阴道炎、宫颈炎等生殖系统感染性疾病会导致宫颈、阴道局部免疫力低下，且长期的炎性刺激也会增加尖锐湿疣的复发风险[10]。从不或很少使用安全套也是引起尖锐湿疣复发的危险因素[11]。因此，在尖锐湿疣的治疗过程中，需要明确告知患者养成良好的生活习惯，忌饮酒，合理使用安全套，保持良好的个人卫生，有助于减少尖锐湿疣治疗后复发。

本研究观察了不同HPV感染亚型与T淋巴细胞亚群表达的关系，结果显示，HPV感染高危型患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平低于低危型，且HPV感染亚型与CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平呈负相关，说明不同HPV感染亚型患者T淋巴细胞亚群表达存在差异。但目前临床关于不同HPV感染亚型患者T淋巴细胞亚群表达的差异相关报道较少。本研究并没有对尖锐湿疣患者HPV感染亚型与T淋巴细胞亚群表达之间的关系进行阐明，且HPV感染与T淋巴细胞亚群表达的关系复杂，可能涉及黏附分子、抗原提呈等多个因素的相互作用。

HPV感染的主要细胞为皮肤黏膜鳞状上皮细胞，侵入机体后可在基底层角质复制，引起宿主细胞异常增殖[12]。HPV亚型包括高危型与低危型，由于HPV很难在体外培养，因此不同亚型HPV感染引起的尖锐湿疣发病机制尚未阐明。上海地区2017年至2018年男性尖锐湿疣流行病学调查显示，HPV感染亚型中高危型以16/52/51型为主，低危型以6/11型为主[13]。在初发尖锐湿疣患者中以HPV6、HPV11单一感染常见，但高危型HPV16占多重感染的60%，且复发率显著高于其他类型HPV感染[14]。本研究结果显示，HPV感染高危型是尖锐湿疣复发的危险因素，说明尖锐湿疣复发与HPV感染亚型有关。高危型HPV感染与低危型相比具有更强的致病性，且高危型感染所致的细胞分化程度较低，会影响宿主对病原体的识别，导致HPV持续感染，引起尖锐湿疣复发。HPV16型E6、E7蛋白能通过调节转录因子小核仁RNA宿主基因12，促进细胞增殖、迁移，并通过细胞外调节蛋白激酶/Slug蛋白途径促进上皮-间质转化[15]。

尖锐湿疣的复发也与机体无法对HPV感染产生有效的免疫应答有关，机体免疫应答异常可引起HPV免疫逃逸，导致HPV在体内持续感染，引起尖锐湿疣复发[16]。男性肛门HPV感染率与CD4+T细胞计数有关，随着CD4+T细胞计数增加，HPV感染率显著降低[17]。本研究结果显示，CD3+、CD4+/CD8+高是尖锐湿疣复发的保护因素，说明尖锐湿疣复发与T淋巴细胞亚群表达有关，与上述研究结果一致。王海霞等[18]研究证实，尖锐湿疣HPV感染的妊娠女性存在显著的Th1/Th2免疫失衡，且Th1/Th2免疫失衡可影响患者的妊娠结局。CD4+T细胞可增强机体的免疫应答过程，CD8+T细胞则具有免疫抑制作用，2种T细胞的相互拮抗可调节机体的免疫应答过程，当CD4+/CD8+降低可引起免疫系统紊乱，导致HPV持续感染，并减弱机体对HPV的清除能力，导致尖锐湿疣治疗后复发。

综上所述，不同HPV感染亚型女性尖锐湿疣患者T淋巴细胞表达差异显著，且T淋巴细胞亚群表达与疾病复发密切相关。临床可根据HPV感染亚型、T淋巴细胞亚群表达对尖锐湿疣患者治疗后复发情况进行预测，并采取免疫疗法治疗尖锐湿疣，减少治疗后复发。本研究为观察性研究，无法明确HPV感染亚型、T淋巴细胞亚群在尖锐湿疣发病、进展中的作用机制，以及HVP感染亚型与T淋巴细胞亚群之间的相互作用。