入侵云南草地贪夜蛾的分子鉴定

张磊 靳明辉 张丹丹 姜玉英 刘杰 吴孔明 萧玉涛

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摘要草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（J.E Smith）是一种原产于美洲热带和亚热带地区的重要农业入侵害虫，目前已从缅甸进入我国云南西南部地区，且呈现蔓延之势。对入侵物种快速准确鉴定是早期预警和监测预防的关键。本研究采用分子标记手段，对采自云南5个县（市）的83份样品进行鉴定，通过PCR扩增细胞色素C氧化酶第1亚基（COI）和磷酸甘油醛异构酶（Tpi）两个基因片段并进行序列测定分析。结果表明，基于CA）I基因片段的序列比对能够对草地贪夜蛾进行准确的物种鉴定，并且能够对其近源种甜菜夜蛾等进行鉴定。基于Ypi基因序列的特异单倍型位点比较分析，确认入侵我国的草地贪夜蛾均为“玉米型”。该研究为草地贪夜蛾的快速识别提供了方法支持，同时为进一步的虫源地解析和遗传溯源积累了宝贵的前期数据。

关键词草地贪夜蛾;DNA条码;单倍型;亚群

中图分类号：S 435.132文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh.2019121

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda，也称秋黏虫，具有杂食性、迁飞性、暴发性的特点。该虫广泛分布于美洲大陆，虽然在热带和亚热带地区以外区域不能越冬存活，由于其远距离迁飞能力，在温度适中的夏季和秋季，其危害范围能够向北延伸至加拿大。随着全球经济一体化的发展，国际交流和进出口贸易成为生物入侵的一个主要通道。草地贪夜蛾于2016年在非洲首次被发现，两年时问内迅速扩散至撒哈拉以南几乎44个国家，造成严重的玉米减产。2018年5月草地贪夜蛾首次确认侵入印度，2018年底已经在缅甸形成虫源基地，并通过中缅边境零星进入我国云南境内，严重威胁我国的粮食作物安全生产。

准确迅速地进行物种识别，是外来入侵生物综合防控的关键技术。夜蛾科灰翅夜蛾属Spodoptera包含有多种重要农业害虫，包括常见的甜菜夜蛾S ex-igua和斜纹夜蛾S.litura等，均具有杂食性、分布广泛等特点，由于形态特征相近，仅从外形难以区分，给传统的形态学鉴定带来一定的挑战，且传统的形态学鉴定方法受到虫态、亚群、单倍型等影响，很容易与其他近缘物种混淆，急需开发分子手段，补充形态学鉴定的局限性，达到快速准确鉴定的目的。

当前针对草地贪夜蛾分子鉴定的主要标记有扩增片段长度多态性（amplified fragment length poly-morphisms，AFLP）、线粒体细胞色素C氧化酶亚基工基因（cytochrome c oxidase subunit I COD。以及位于Z染色体上的磷酸甘油醛异构酶基因（tri-ose-phosphate isomerase，Zpi）。其中基于线粒体OOI基因的序列分析是目前最常用也是最有效的分子条码，基于个别SNP位点的比对还能够达到鉴别草地贪夜蛾不同亚型的目的。研究显示草地贪夜蛾雌性“水稻型”和雄性“米型”存在一定比例的杂交，由于线粒体母系遗传的特征，因此往往容易造成分子鉴定结果的不一致。除CO工基因外，位于Z染色体的rpi基因也是草地贪夜蛾鉴定的标记基因，该标记由于位于核基因组，与寄主植物相关性更强，且在不同亚型鉴定上显示出比线粒体标记更加准确的特性。将两种标记鉴定方法有机结合，互为补充，互相验证，可保证鉴定结果更加可靠。

本研究利用COI和Tpi两个基因片段对入侵我国的草地贪夜蛾进行分子鉴定，探究该物种的快速识别技术，对于进一步明确其虫源信息及其发生特征和暴发规律，以及指导草地贪夜蛾的监测预警和早期控制具有重大意义。

1材料与方法

1.1试验材料

本次研究的样品一共有83份，采集地点包括云南省德宏州的瑞丽市、芒市、陇川县、盈江县和普洱市江城县等5个县（市），寄主均为苗期至抽雄初期的冬玉米，每个地点样品数2份至35份不等，所有样品均为幼虫。样品采集后放入泡沫箱，活体常温运送至实验室，采用新鲜玉米叶片喂养，具体样品信息见表1。

1.2DNA提取及PCR扩增

样品DNA提取采用Muifisource Genomic DNAMiniprep Kit试剂盒，单头虫体用液氮研磨后，按照说明书进行标准操作，纯化的DNA经过1%琼脂糖电泳检测，使用NanoDrop ND-2000仪器测定浓度，用作PCR扩增模板。

分別对CO工基因和gpi基因片段进行PCR扩增，引物序列见表2，采用全式金2×EasyTQq酶进行PCR扩增，PCR反应体系如下（50uL）：DNA模板5uL，正反向引物各1.5uL，2×EasyTaq mix25uL，dd H217uL。PCR反应程序：94℃预变性5min，34个循环，每个循环94℃变性30S，60℃退火30S，72℃延伸1min，72℃延伸10min。

PCR扩增结束后，使用1%琼脂糖电泳检测扩增结果，选取与目标片段长度一致的单一片段PCR产物送生工生物工程（3a海）股份有限公司切胶测序，测序引物采用各自片段PCR扩增引物。

1.3数据分析

利用SeqMan和BioEdit软件对正反向测序序列进行人工拼接及峰图校正，获得准确的CO工和Zpi基因片段序列。同时从GenBank数据库下载已经发布的草地贪夜蛾对应基因序列以及Spo-doptera属近缘物种的对应基因序列，去除低质量序列，所有核酸序列采用MEGA5.0软件进行比对，截去两端多余的序列，选取Kimura-2参数模型，依据邻接法（neighbor joining，NJ）构建系统进化树，系统树各分支的自举检验值（bootstrap）1000次重复检验。针对已经报道的基于Tpi基因序列的“玉米型”和“水稻型”单倍型特点，运用DNAMAN软件进行特异位点差异比对，以此确认本研究草地贪夜蛾具体的亚型。

2结果与分析

通过PCR扩增，CO工引物及gpi引物在所有83份样品中均得到很好的扩增效果，条带单一整齐，其中COI基因片段长度约800bp，Ypi基因片段长度约400bp，均与预期片段大小一致（图1）。该结果表明两种基因片段均适合作为草地贪夜蛾分子鉴定的DNA条码，引物显示出很强的种属扩增特异性。

通过序列测定和峰图校正分析，得到了所有83份样品准确的CO工基因片段和Tpi基因片段序列，其中COI片段长度均为789bp，除了采自芒市的1号样品之外，其余82份样品的COI序列完全一致。Tpi片段长度为386～388bp，其中芒市的1号样品序列长度为388bp，其余82份样品的序列长度均为386bp且序列完全一致。序列比对结果显示芒市1号样品与其余样品的CO工序列相似度为92.9%，ypi序列相似度仅为83.76%，表明芒市1号样品极有可能为不同的物种，而其余82份样品为同一物种。

根据本研究测定的CO工序列及GenBank数据库中下载的18条Spodoptera属近缘物种COI序列，以棉铃虫Helicoverpa armigera COI序列作为外群，采用NJ法构建系统发育树（图2），由于本研究中有82份样品序列完全一致，仅选取瑞丽1号样品作为代表。

从系统树可以看出，COI基因片段能够将Spodoptera属不同个体按照各自所属的物种明显地区分开来，来自同一物种的不同个体均优先聚在一起，且各分支均具有较高的支持率。其中采自云南的样品与之前研究发表的草地贪夜蛾聚为一支，表明云南的所有82份样品均为草地贪夜蛾，而采自芒市的1号样品与甜菜夜蛾聚为一支，可将芒市1号样品鉴定为甜菜夜蛾。且从系统进化树可以看出，草地贪夜蛾与S.d0lichos和S.pulchella显示出更近的亲缘关系。

将本研究测定的草地贪夜蛾Tpi基因序列与之前研究发表的两种亚型对应的Tpi基因序列进行单倍型比对分析，结果显示在能够区分“水稻型”和“玉米型”的10个多态性单倍型中，云南样品在所有10个位点与“玉米型”单倍型完全一致（图3），证明所鉴定的82份草地贪夜蛾样品均为“玉米型”。鉴于本研究采样地点全部来自玉米种植区，因此更加确认早期入侵我国的草地贪夜蛾属于“玉米型”。

3讨论

草地贪夜蛾作为一种入侵性极强的毁灭性害虫，其入侵风险评估、快速识别技术和监测预防工作显得尤为重要。当前，由草地贪夜蛾的快速扩散和严重为害引发全球关注，多国已经启动应急处置预案，联合制定综合治理方案，欧洲已将其作为检疫害虫。由于我国并没有草地贪夜蛾本地种，此次草地贪夜蛾从缅甸入侵我国，如不引起足够重视，一旦全面暴发，后果将难以控制，给我国农业发展带来严峻挑战。

草地贪夜蛾在原产地美洲长期进化过程中分化成两种生态型，根据取食寄主植物的不同分为“玉米型”和“水稻型”，前者主要取食玉米和高梁，后者主要取食水稻和狗牙根等草坪草。这两种生态型在雌性性信息素成分、交配行为等生理学方面具有较为明显的差异，然而两种亚型之问并没有绝对的生殖隔离，有报道显示两种亚型之问存在一定比例的杂交，给基于生理学差异和基于寄主选择性的表型鉴定带来更多的不确定性，并且两种亚型在外部形态特征上基本一致，无法进行有效的形态学区分，目前开发分子标记是对两种亚型进行区分的最有效手段。除此之外，草地贪夜蛾在低龄幼虫期以及卵阶段难以与其他近缘物种进行区分，也需要借助分子手段的辅助鉴定。对入侵害虫进行快速准确的鉴定分型，明确其为害特征，有助于提前科学布局和开展针对性的防控措施，减少农林经济损失，因此，开展基于分子辅助手段的鉴定工作很有必要且意义重大。

本研究采用分子标记手段，对入侵我国的草地贪夜蛾进行了准确的物种鉴定。所选取的两个片段在所有样品均得到较好的扩增，表明两种标记都能够达到对该物种进行快速鉴定的目的。同时，本研究采用的引物通用性强，对甜菜夜蛾DNA也能进行有效扩增，可以应用于Spodo ptera属近缘物种的分子鉴定。且进一步通过Tpi基因序列特异位点单倍型分析，确认入侵我国的草地贪夜蛾为“玉米型”。由于本次研究的82份草地贪夜蛾样品COI和Tpi两个基因片段序列完全一致，推测入侵云南5个县（市）的草地贪夜蛾均来自同一虫源地，或侵入中國之后进行的扩散。

作为一种国际性重大迁飞农业害虫，当前针对草地贪夜蛾的研究日益增多，采用COI和TPI等分子条码能够有效地对草地贪夜蛾进行物种鉴定，很容易与其他物种进行区分。但是，对于“玉米型”和“水稻型”的区分依然是研究的难点，当前也仅仅是依靠个别基因有限SNP位点的单倍型进行鉴定，由于草地贪夜蛾迁飞性强且分布广泛，候选基因往往变异速率快，不少研究表明在相关位点出现杂合的现象，给鉴定分型带来困扰。一直以来针对两种亚型分析的方法也不断改进，对鉴定的准确性要求不断提高，然而，依然需要开发更多与取食寄主关联的遗传标记位点，达到鉴定的系统性和多重验证。尽管目前两种亚型的基因组数据已经发布，然而关于两者取食不同寄主直接的基因和相关机制并未阐明，因此仅能通过与表型性状关联的分子特征进行亚型区分。

两种不同亚型的草地贪夜蛾往往同时发生，目前非洲已经有两种亚型的定殖为害。本研究虽然鉴定入侵我国云南地区的草地贪夜蛾均为“玉米型”，但是由于取样地点和取样数目的局限性，并不能完全排除“水稻型”草地贪夜蛾已经侵入我国，需要做好更大范围的监测和调查。此外，关于本次研究的草地贪夜蛾的最初来源仍需要进一步确认，通过序列比对构建系统树从而分析源头的方法已证实可行。由于缅甸以及中国并没有草地贪夜蛾本地种，需要深入厘清其来源，从源头进行控制和管理，明确草地贪夜蛾发生动态规律，为指导草地贪夜蛾的科学防控提供更加可靠的信息。