忍冬叶不同溶剂提取物与抗氧化的谱效关系研究

南敏伦，尹 涵，司学玲，张瀚水，林宇琪，马春霞，赵昱玮，赫玉芳*

（1.吉林省中医药科学院，长春 130012；2.吉林农业大学，长春 130118；3.修正药业集团长春高新制药有限公司，长春 130012；4.长春工业大学，长春 130021；5.长春中医药大学，长春 130117）

本研究采用高效液相色谱-串联质谱（HPLCMS/MS）法，建立忍冬叶11种不同溶剂提取物的指纹图谱，通过与对照品、文献信息比对指认共有峰对应的化合物，再结合各提取物抗氧化活性，通过灰色关联度法（GRA）和偏最小二乘法（PLS）联合分析共有峰与抗氧化活性的谱效关系，旨在为忍冬叶抗氧化的药效物质研究提供参考，为进一步开发忍冬叶提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100 series LC-MSD 型液质联用仪，包括Agilent SL 型多级离子阱质谱仪、低压四元梯度泵、二极管阵列检测器（DAD）、Chemistation化学工作站等（美国Agilent公司）；QUINTIX35-1CN型十万分之一电子天平（赛多利斯公司）；iMark型全自动酶标仪（美国BIO-RAD伯乐公司）；DR3900 台式分光光度计（美国HACH）。

1.2 药品与试剂

忍冬叶药材（批号：210501）购自安国振国中药材有限公司，经吉林省中医药科学院赵全成研究员鉴定其为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb）的干燥叶；马钱苷、绿原酸、3,4-二羟基肉桂酸、芦丁、木犀草苷、金丝桃苷、槲皮素、木犀草素对照品（批号分别为111640-201707、110753-201817、110885-201602、100080-201408、111720-201810、111521-201704、100081-201706、111520-201605，纯度：≥98%，中国食品药品检定研究院）；其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 忍冬叶不同极性提取物制备

称取忍冬叶药材，分别用8倍量50%、60%、70%、80%、90%乙醇和蒸馏水，提取2次，每次1 h，滤过，分别合并提取液，浓缩，干燥，即得6种忍冬叶提取物，记为S1～S6。另称取忍冬叶药材，依次用8倍量95%乙醇、75%乙醇各提取2次，每次1 h，滤过，合并提取液，浓缩，加水至每毫升含2 mg药材，再依次用石油醚（30～60 ℃）、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇振摇提取，将上述4种滤液和振摇提取后的水相分别回收，干燥，即得5种忍冬叶提取物，记为S7～S11[1]。

2.2 忍冬叶提取物指纹图谱的建立

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Alphasil C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-2%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～15 min 7%A，15～50 min 7%A→ 25%A，50～ 70 min 25%A→ 35%A，70～ 90 min 35%A→ 55%A，90～ 95 min 55%A→7%A，95～100 min 7%A；流速：0.9 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 质谱条件 以HESI为离子源；负离子检测；扫描范围为m/z 100～1 500；传输管温度为350 ℃，辅助气温度为450 ℃；碰撞能量为30 eV；检测方式为Full-MS/dd-MS2； dd-MS2分辨率为35 000。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取上述11种提取物，研细，各0.1 g，分别置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解，滤过，即得各供试品溶液。

2.2.4 对照品混合溶液的制备 分别精密称取马钱苷、绿原酸、3,4-二羟基肉桂酸、芦丁、木犀草苷、金丝桃苷、槲皮素、木犀草素对照品适量，加甲醇制备成质量浓度分别为0.02、0.1、0.01、0.005、0.05、0.01、0.005、0.005 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.5 仪器精密度试验 取70%忍冬叶乙醇提取物制备的供试品溶液（编号：S3），按色谱条件连续进样测定6次，记录20个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。以金丝桃苷色谱峰为参照峰，结果表明，相对保留时间的RSD均小于0.86%（n= 6），相对峰面积的RSD均小于1.88%（n= 6），表明本仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取忍冬叶70%乙醇提取物制备的供试品溶液（编号：S3），按色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h时进样测定，记录20个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。以金丝桃苷色谱峰为参照峰，结果表明，相对保留时间的RSD均小于0.65%（n= 6），相对峰面积的RSD均小于1.76%（n= 6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取忍冬叶70%乙醇提取物（编号：S3），共6份，制备得到6份供试品溶液，按色谱条件测定，记录20个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。以金丝桃苷色谱峰为参照峰，结果表明，相对保留时间的RSD均小于0.59%（n= 6），相对峰面积的RSD均小于1.76%（n= 6），表明该方法重复性良好。

2.2.8 指纹图谱生成及特征峰确认 取“2.2.3”项下制备的11种忍冬叶提取物的供试品溶液，按“2.2.1”“2.2.2”项下条件进行分析，得总离子流图。将图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012年版）中，以 S3为参照图谱，时间窗宽度为0.2 min，图谱间距为20 mV，选择中位数法，生成11种提取物指纹图谱的共有模式见图1，各共有峰峰面积见表1。根据各色谱峰的准分子离子峰、二级质谱碎片信息，并通过与对照品、化学成分数据库、文献信息[2-4]比对指认忍冬叶中的化学成分。结果，11种忍冬叶提取物中有共有峰20个，化学成分指认结果见表2。

表1 忍冬叶不同极性提取物共有峰蜂面积实验结果

表2 忍冬叶提取物中化学成分的分析结果

图1 11种忍冬叶提取物色谱峰共有模式图

2.3 忍冬叶提取物抗氧化作用

2.3.1 DPPH 自由基清除率的测定 配制含DPPH 0.04 mg·mL-1的乙醇溶液和不同浓度忍冬叶各提取物溶液（0.05，0.1，0.25，1.0，2.0，4.0，8.0 mg·mL-1）。分别取不同浓度的各忍冬叶提取物溶液80 μL，分别加入200 μL 上述DPPH溶液，密闭、室温、避光条件下反应 20 min后，在520 nm 下测定吸光值，以DPPH 溶液为空白对照组，按公式计算清除率： 清除率（%）=（1-实验组OD值÷空白组OD值）×100%，试验重复3次。以不同质量浓度各忍冬叶提取物浓度为横坐标，清除率为纵坐标作图，得到线性方程，计算其IC50值，以IC50值作为评价各忍冬叶提取物抗氧化强弱的指标[5]。

2.3.2 总还原能力的测定 取1.0 mL不同浓度的各忍冬叶提物溶液（0.5，1，2，4，8，12，16 mg·mL-1），依次加入pH = 6.6的0.2 mol·L-1的磷酸盐缓冲液2.5 mL的和1%铁氰化钾溶液2.5 mL，置50 ℃条件下保温20 min 后置冰水中冷却，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，离心（4 000 r·min-1）8 min，取5.0 mL上清液，依次加入去离子水 5.0 mL和0.1%三氯化铁溶液1.0 mL，静置10 min，以去离子水为空白对照，在700 nm 处测吸光值。试验重复3次。以不同质量浓度各忍冬叶提取物浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到线性方程，计算其IC50值[6]。

由表3结果显示，在 0.05～8.0 mg·mL-1浓度范围内，各忍冬叶提取物对 DPPH 自由基均具有清除作用，其中S9组的活性最强，其 IC50值为（1.08±0.15） mg·mL-1，活性最差的为S11组，其 IC50值为 （8.04±0.18） mg·mL-1；不同组别忍冬叶提取物随浓度增加其清除自由基的能力也逐渐增强。由于抗氧化剂具有强的还原能力，可以将体内的三价铁还原成二价铁，增强血红蛋白对氧的运输能力，可以与自由基反应。在 0.5～16 mg·mL-1浓度范围内，不同组别忍冬叶提取物均具有较强的还原能力，其中S9组的活性最强，其 IC50值为（3.41±0.10） mg·mL-1，活性最差的为S11组，其 IC50值为 （13.58±0.16） mg·mL-1；表明忍冬叶提取物可作为抗氧化剂提供电子，具有较强还原性。

表3 各组清除DPPH 自由基、还原能力的试验结果

2.4 忍冬叶化学成分与抗氧化的谱效分析

2.4.1 GRA 利用DPS-3.01软件，根据忍冬叶各提取物清除DPPH 自由基IC50及还原力IC50计算的活性数据，加权系数均为0.5。将各共有峰峰面积与抗氧化活性数据进行关联。通过对数据进行标准化处理后，计算其关联度，得到各峰对抗氧化活性的贡献高低[7]。实验结果表明，20个共有峰与抗氧化活性的关联度均＞0.8，其排名前九位的共有峰分别为：峰5＞4＞16＞17＞18＞20＞19＞1＞9，见表4。

表4 忍冬叶提取物中20个共有峰与抗氧化的GRA分析结果

2.4.2 PLS 利用SIMCA-11软件，经过多次提取主成分，多次迭代，拟合出20个共有峰对抗氧化的贡献程度，计算标准化回归系数[8-9]，见表5。

表5 忍冬叶提取物中20个共有峰与抗氧化活性的PLS分析结果

由表4结果可知，其各成分对抗氧化活性的贡献程度与GRA的分析结果基本一致。除峰8、6、10、11呈负相关外，其余各峰均与抗氧化活性的回归系数均大于0，成正相关，排名前九位的共有峰分别为：峰5＞4＞16＞18＞17＞19＞20＞1＞9，与GRA结果基本一致。

3 讨论

据文献[2]报道，忍冬叶中主要成分是酚酸类及黄酮类成分，此外还有少量的萜类、苷类、挥发油、生物碱等多种成分。由于化学成分类别的多样性，提取方法也较多，通常情况下回流提取能有效的提取其中的化学成分，本研究选择了回流提取法。不同类化学成分在不同极性溶剂中的溶解性具有明显差异，挥发油易溶于石油醚中，生物碱溶于三氯甲烷中，酚酸类、黄酮苷元溶解于高浓度乙醇或乙酸乙酯中，黄酮苷、皂苷易溶解于低浓度乙醇或正丁醇中，多糖溶于水中，为了尽可能的将各类成分均提取出来，选择了本研究中提取方法，提取得到了11种提取物。

对抗氧化活性实验结果表明，11种忍冬叶提取物对 DPPH 自由基均具有清除作用，其中乙酸乙酯提取物的活性最强，其 IC50值为（1.08±0.15）mg·mL-1，活性最差的为经过不同溶剂萃取后的水提取物，其IC50值为（8.04±0.18）mg·mL-1；11种忍冬叶提取物随浓度增加其清除自由基的能力也逐渐增强。11种忍冬叶提取物均具有较强的还原能力，其中乙酸乙酯提取物的活性最强，其 IC50值为（3.41±0.10）mg·mL-1，活性最差的为不同溶剂萃取后的水提取物，其 IC50值为（13.58±0.16）mg·mL-1，表明忍冬叶提取物可作为抗氧化剂提供电子，具有较强还原性。实验结果表明其中乙酸乙酯提取物抗氧化作用最强。

本研究分析了忍冬叶11种提取物中20个化学成分，通过谱效分析确定了其中具有抗氧化活性的主要化学成分可能为峰 5、4、16、17、18、20、19、1、9，即3,4-二羟基肉桂酸、绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素、槲皮素、5-咖啡酰奎宁酸、4-咖啡酰奎宁酸，主要为酚酸类及黄酮类化合物，研究结果提示忍冬叶抗氧化活性可能与上述物质相关。由于酚类物质及黄酮类化合物含有一个或者多个酚羟基，这些酚羟基的存在使之具有良好的抗氧化活性[10]。尽管有文献[11]报道忍冬中三萜类和多糖类成分亦具有一定的抗氧化活性，但与其中的酚类成分比较，抗氧化活性相对较弱。本研究印证了忍冬叶中抗氧化活性成分主要为酚酸类及黄酮类成分，同时明确了各成分抗氧化活性的强弱，对阐明忍冬叶抗氧化的药效物质基础，建立忍冬叶多指标质量控制标准具有明显的积极意义，对于忍冬叶药材的有效开发和利用具有重要的参考价值，对于天然抗氧化剂开发具有重要的理论参考和实际意义。