中心组合设计-响应面法建立荔止痛方提取工艺研究

钟远坚，杨玉婷，潘 可，王 刚，赵立春,

（1.广西中医药大学药学院，南宁 530200；2.广西壮瑶药工程技术研究中心，南宁 530200）

本实验采用回流提取法，以“荔止痛方”中治疗睾丸炎功效成分原儿茶酸、柠檬苦素、车叶草苷及干膏收率为指标，选用单因素考察法、中心组合设计-效应面法结合信息熵权法对指标数据进行权重分析，并且对主要的影响因素：溶剂倍数、提取时间、浸泡时间以及提取次数进行优选，力图建立一个稳定、可靠、最优的“荔止痛方”生产提取工艺，在保证其功效的基础上为后续“荔止痛方”治疗睾丸炎研究提供依据[1-2]。

1 设备与材料

1.1 仪器

Waster2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）； PX124ZH 型电子分析天平 [奥豪斯仪器（常州）有限公司]；HC-1000Y型多功能粉碎机（浙江省永康市天祺盛世工贸有限公司）；PL-S80T型康士杰超声波清洗机（东莞康士洁超声波科技有限公司）；DZTW调温电热套（北京市永光医疗仪器有限公司）。

1.2 试药

原儿茶酸（批号：MUST-1710908，含有量99.32%）、柠檬苦素（批号：MUST-17030620，含有量99.39%）、车叶草苷（批号：AF9112301,含有量99.78%）（成都埃法生物科技有限公司）；乙腈为色谱纯（美国Fisher Chemical公司）；其他试剂均为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 原儿茶酸、柠檬苦素以及车叶草苷含有量测定

2.1.1 对照品母液配制 精密称取原儿茶酸、柠檬苦素、车叶草苷对照品适量，分别置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得（三者质量浓度分别为1.040 mg·mL-1、1.050 mg·mL-1、1.10 mg·mL-1）。

2.1.2 供试液配制 称取“荔止痛方”全方药材，共45 g，置于烧瓶中，加水浸泡后，加热回流提取2次后，合并滤液后，用200目滤布过滤，离心10 000 rpm，3 min；过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.1.3 色谱条件 Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈～0.1%磷酸；体积流量1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；检测波长：260 nm（0～25 min）、239 nm（26～70 min）、203 nm（71～120 min）；柱温：30 ℃。色谱方法见表1，色谱图见图1。

表1 HPLC色谱方法

图1 各成分HPLC色谱图

2.1.4 线性关系考察[3-7]精密吸取原儿茶酸、柠檬苦素、车叶草苷对照品母液，分别逐步稀释于5个5 mL棕色量瓶中，加入甲醇定容，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，在“2.1.1”项条件下进样10 μL测定。浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得回归方程分别为原儿茶酸：Y= 29 836X+522.1（r2= 0.999 8），线性范围0.52～2.60 μg；柠檬苦素：Y=4 534.1X-5 807.9（r2= 0.999 4），线性范围21.00 ～ 105.00 μg；车叶草苷：Y= 7 862.5X+3 075.6（r2= 0.999 5），线性范围3.14～15.70 μg。

2.1.5 精密度试验[3-7]取同一对照品溶液，在“2.1.1”项下进样测定6次，每次10 μL，测得原儿茶酸、柠檬苦素、车叶草苷峰面积RSD分别为0.60%、0.60%、0.70%，说明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验[3-7]配制供试液1份，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h 在“2.1.1”项进样测定，测得原儿茶酸、柠檬苦素、车叶草苷峰面积RSD分别为0.74%、1.16%、0.89%，表明溶液在16 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验[3-7]按照“2.1.3”方法，同法配制6份供试液，在“2.1.1”项下进样测定，测得原儿茶酸、柠檬苦素和车叶草苷峰面积RSD分别为1.26%、1.91%，1.85%，表明该方法重复性较好。

2.1.8 加样回收率试验[3-7]配制成分含量已知的供试液9份，精密加入样品含量一半的80%、100%、120%对照品母液，在“2.1.1”项下进样测定，计算回收率。测得原儿茶酸含量平均加样回收率为99.98%，RSD为2.02%；柠檬苦素含量平均加样回收率为99.44%，RSD为2.23%；车叶草苷含量平均加样回收率为100.27%，RSD为2.37%。

2.2 干膏收率测定

取一定量药液，置于已恒重的称量瓶（M1）中，105 ℃烘箱中再次恒重，记录重量（M2），前后重量之差÷药材总量（M）×100%，即得。

2.3 单因素试验

2.3.1 溶剂倍数的考察 固定提取时间为90 min，浸泡时间为45 min，提取2次，改变溶剂倍数，观察其对原儿茶酸、柠檬苦素、车叶草苷以及干膏收率的综合评分的影响。结果见图2。

图2 溶剂倍数与指标综合评分的关系

由图2可知，在溶剂倍数为9～15倍的范围内，综合评分随着溶剂倍数的增加而提高，在15倍数时最高，为2.93；在这个范围内，综合评分直线上升，说明溶剂倍数对于提取工艺影响较大。15～21倍的范围内，综合评分总体持平，但不明显。三个试验误差线相互重叠，原因可能是用大约15倍左右水提取2次，已经基本完成了对于药效成分的全部提取，因此即使随着溶剂倍数不断提高，在药效成分已经最大限度被提取的情况下，指标成分变化不大，故出现基本持平。即判断在12～18倍数之间，可能出现最高药效成分含量的拐点，提供了响应面可选的水平范围。

2.3.2 提取时间的考察 固定浸泡时间为45 min，溶剂倍数为15倍，提取2次，改变提取时间，观察其对原儿茶酸、柠檬苦素、车叶草苷以及干膏收率的综合评分的影响。结果见图3。

图3 提取时间与指标综合评分的关系

由图3可知，在30～150 min范围内，指标综合评分整体呈现上升趋势。在30～90 min时间段与在90～150 min时间段相比，上升趋势较快。推测可能原因为，在前90 min提取时间内，药效成分已经大部分被提取出来，上升较快；因此90～150 min范围内，只是小部分的药效成分被缓慢提取，上升减缓。总体指标综合评分仍然在不断上升，说明药效成分还未提取完全；曲线上升趋势减缓，说明可能已经出现了药效成分提取效率最高的时间90～150 min范围内，虽然指标综合评分不断上升，但提取效率相对前90 min较低。即判断在60～120 min之间，可能出现了指标成分提取效率高低的拐点，提供了响应面可选的水平范围。

2.3.3 浸泡时间的考察 固定提取时间为90 min，溶剂倍数为15倍，提取2次，改变浸泡时间，观察其对原儿茶酸、柠檬苦素、车叶草苷以及干膏收率的综合评分的影响。结果见图4。

图4 浸泡时间与指标综合评分的关系

如图4可知，在15～30 min范围时，指标综合评分随着浸泡时间而增长；在30～75 min范围内，随着浸泡时间不断增加，指标综合评分并未出现明显继续上升趋势。推测可能原因为，在45 min前，已经完成将药材浸透的目的，故在45 min后浸泡时间继续增加，对指标综合评分影响不大。即判断在15～45 min之间，可能出现拐点，提供了响应面可选的水平范围。

2.3.4 提取次数的考察 固定提取时间为90 min，浸泡时间为45 min，溶剂倍数为15倍，改变提取次数，观察其对原儿茶酸、柠檬苦素、车叶草苷以及干膏收率的综合评分的影响。结果见图5。

图5 提取次数与指标综合评分的关系

由图5可知，提取次数为1～3时，随着提取次数增加，指标综合评分持续上升。第3次、第4次相比，提取指标综合评分不再继续上升。推测可能原因为在经过3次提取之后，药效成分已基本提取完全，继续增加提取次数，已经没有更多的药效成分提出。因此，确定提取次数为3次。

2.4 中心组和设计-响应面法（CCD）

在单因素试验基础上，发现A（溶剂倍数）、B（提取时间）、C （浸泡时间）三个因素对提取工艺的影响较大，故选择这三个因素进一步进行中心组合设计-响应面法优化。基于单因素试验结果，因素范围分别为A（12～21倍）、B（60～120 min）、C（15～75 min），进行3因素5水平中心组合试验设计。每个试验分别计算4个指标的归一值“OD”，以其综合评分作为该试验的总评“OD”，总评OD=各指标归一值×权重系数之和。因素水平见表2，结果见表3。

表2 因素水平

表3 试验设计及结果

2.5 信息熵权法[8-9]

对于某项指标而言，可以用熵值来判断某个指标的离散程度，其信息熵值越小，指标的离散程度越大，说明该指标越重要；反之，该指标越不重要。计算得出原儿茶酸、柠檬苦素、车叶草苷、干膏收率的权重系数依次为0.238 0，0.254 2，0.255 8，0.252 0。

2.6 模型拟合及显著性分析

应用 Design-Expert 8.0.6软件对表3数据进行多元回归拟合，得回归方程Y= 0.84+0.033A+0.12B+0.039C+0.067AB+0.055AC+0.027BC-0.12A2-0.11B2-0.19（r= 0.985 3），表明模型拟合度良好，误差较小，方差分析见表4。由表4可知，整体模型（P＜0.000 1），有显著性差异；失拟项（P＞0.05），失拟不显著，说明回归方程的拟合程度和可信度均较好。因素A （溶剂倍量）影响显著（P＜0.05），B（提取时间） 极显著（P＜0.000 1），C （浸泡时间）极显著（P＜0.01），影响程度依次为B＞C＞A。交互项AB、AC影响显著 （P＜0.05）；BC不显著 （P＞0.05）；二次项A2、B2、C2极显著。

2.7 模型预测与修正

见图6。由此可知，预测最优工艺为：溶剂倍量为18.16，提取时间为110.56 min，浸泡时间为51.23 min，提取3次，总评OD值为0.894。考虑实际生产成本等因素，最终将其修正为18倍量水，浸泡51 min，提取110 min，提取3次。

图6 各因素响应面图

2.8 验证试验

称取“荔止痛方”全方药材，共45 g，按“2.7”项下最优工艺进行3批验证试验。优选工艺结果显示，在修正后提取工艺下，功效成分以及干膏收率的综合评分均较高，并且相近，提示修正后的提取工艺是适宜、稳定、可靠的。结果见表4。

表4 验证试验结果（n= 3）

3 讨论

原儿茶酸、柠檬苦素以及车叶草苷均有紫外吸收，但其最大紫外吸收波长不同，结合实验需要，实验采用多波长同时扫描测定，保证三种指标成分在各自最大紫外吸收波长条件下，出现在同一色谱图上。信息熵权法常用于多指标成分的综合评价，其从数据分布上分析客观反应了指标的权重大小，本研究采用该方法较为客观的反应了原儿茶酸、柠檬苦素、车叶草苷以及干膏收率的权重系数的大小[10-11]。

对于中药活性成分提取来说，溶剂倍数、提取时间、浸泡时间、提取次数、中药材前处理、提取温度等共同影响着药效成分的提取。对于中药材的前处理，在实验设计之初，考虑将荔枝核粉碎后提取，本课题组在前期研究中发现，将荔枝核粉碎后提取，容易出现糊化现象，并分析推测可能由于荔枝核淀粉、多糖等大分子物质导致，故未将荔枝核粉碎后提取。加上本方分别包含种子类和草本中药材，已有报道两类中药材所需浸泡时间相差较大，因此将浸泡时间优先设置为重要考察因素。在预实验，本研究对于常规提取工艺中的重要因素提取温度也进行了考察，最高温度设置为100 ℃，曲线呈直线上升趋势。结合生产成本等考虑，就将温度定为100℃。

单因素考察试验后发现，药材的活性成分含量有限，在一定范围内，药效成分能被快速、大量的提取出来；而超过这个范围后，提取效率急剧下降。溶剂倍数、提取时间、浸泡时间对指标综合评分影响较大；提取3次之后，对于指标综合评分几乎无影响。单因素考察限定于单个因素对于整个提取工艺的影响，很难再进一步同时对几个因素的整体作用进行分析。因此，单因素考察之后，采用中心组合设计-响应面法（CCD）进一步研究各个因素之间的协同或者拮抗关系。CCD结果可知，回归方程拟合程度、可信度较好，提取工艺最优的预测条件为：溶剂倍数为18倍、提取时间为110 min、浸泡时间为51 min，提取3次。3批次验证实验结果证明，该工艺是适宜、稳定、可靠的。

通过建立稳定、可靠、最优的“荔止痛方”提取工艺为后续进一步开展药效试验研究提供依据。