胶体金法评估血清百日咳毒素抗体IgG水平的初步研究

胡亚红 刘丹丹 高薇 孟庆红 姚开虎

百日咳是疫苗可预防疾病，确诊依赖于实验室诊断[1]。有免疫接种史的青少年和成人罹患百日咳时，多因初期病情较轻而易被忽视，致就诊时间较晚而失去细菌学或核酸检测时机[2]。此时，应该考虑血清学诊断方法。百日咳毒素(pertussis，PT)为百日咳鲍特菌所特有，并且免疫原性强，故PT-IgG抗体检测易于标准化[3]。PT也是百日咳疫苗主要抗原成分之一，PT-IgG抗体水平也可反映疫苗或自然感染后机体获得的特异免疫水平。目前，临床上检测PT-IgG 抗体常用的方法为酶联免疫法(ELISA)[1]。胶体金试纸条是以胶体金为标志物，依据层析作用检测抗原、抗体反应，操作便捷、经济且检测时间短，易于推广使用，已广泛应用于医学检验领域[4]。本研究采用诊断性试验设计，对胶体金法评估PT-IgG水平的准确性进行评价，为临床选择血清学检测方法评估百日咳免疫水平和诊断百日咳提供参考依据。

材料和方法

一、研究对象

根据临床送检要求，按送检倒序时间从首都医科大学附属北京儿童医院实验室冻存于零下30 ℃的血清样本中连续选取6个月内的PT-IgG检测结果<20 IU/ml和≥20 IU/ml的标本各100份(ELISA检测，试剂盒由德国欧蒙有限公司生产)，因1份标本量不足以完成3项检测予以排除，最终纳入199份样本作为研究对象。其中，浓度分布在<5、5～<20、20～<80、≥80 IU/ml者分别为50、50、76、23份。

二、检测方法

1.ELISA法检测：为保证血清样本在同一时间检测状况的一致性，研究再次使用ELISA法检验血清PT-IgG抗体水平。采用试剂盒为德国赛润有限公司生产，按照说明书步骤操作。在已包被有PT抗原标板中，分别加入待检测血清和参考品，依次加入酶标记的抗人IgG抗体和底物，于37 ℃孵育，显色后加入终止液。酶标仪读取样本吸光度值并计算样品抗体浓度(IU/ml)。

2.胶体金法：由编盲员对入选标本进行随机编号，再分别交给两组人员进行不同界值的胶体金法检测。最后揭盲并整合分析结果。采用武汉生命科技股份有限公司生产的百日咳PT-IgG胶体金试纸条(图1)进行检测。方法如下：于加样孔依次加入10 μl血清、样本稀释液50 μl，加样后20 min读取结果。判读方法：将同时出现红色检测线和质控线判断为阳性，将仅出现质控线且未出现检测线判断为阴性，将仅出现检测线或无检测线和质控线出现判断为无效(图2)。本研究中的胶体金试纸条采用20 IU/ml 作为百日咳免疫保护界值，80 IU/ml作为百日咳感染的诊断界值(疫苗接种超过1年)。

图1 百日咳PT-IgG胶体金试纸条

图2 百日咳PT-IgG胶体金法检测结果判读

三、统计学处理

采用SPSS 26.0软件进行数据处理。以ELISA法检测结果为参照标准，使用敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和约登指数等指标评估胶体金法的检测效能，其中约登指数值范围为0～1，指数越大其真实性越好。计数资料以“标本份数/百分率(%)”描述。

结 果

一、检测界值为20 IU/ml的胶体金检测结果

199份标本中，ELISA检测血清PT-IgG浓度≥20 IU/ml的标本有105份(52.8%)，而胶体金法检测阳性为84份(42.2%)。以ELISA检测结果为参照标准，胶体金法检测的敏感度、特异度、阳性漏检率、误检率、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比和约登指数分别为76.2%(80/105)、 95.7%(90/94)、23.8%(25/105)、4.3%(4/94)、95.2%(80/84)、78.3%(90/115)、17.7、4.0和0.7。具体见表1。

表1 胶体金法以ELISA检测结果为参照标准评估PT-IgG抗体水平的检测效能

二、检测界值为80 IU/ml的胶体金检测结果

199份标本中，ELISA法检测有23份(11.6%)血清PT-IgG浓度≥80 IU/ml，以80 IU/ml为检测界值的胶体金法有76份(38.2%)阳性。以ELISA检测结果为参照标准，胶体金法检测的敏感度、特异度、阳性漏检率、误检率、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比和约登指数分别为100.0%(23/23)、 69.9%(123/176)、0.0%(0/0)、30.1%(53/176)、30.3%(23/76)、100.0%(123/123)、0.3、0.0和0.7。具体见表1。

讨 论

百日咳是一种由百日咳鲍特菌引起的传染性极强的呼吸道疾病，婴儿罹患百日咳时病情可迅速进展，易出现并发症，病死率高[5]。接种百日咳疫苗后，近期的保护效力相对较高，但4～5年后的保护效力下降至50%左右，且随着时间的推移，下降幅度更大[6]。感染百日咳鲍特菌后可发生百日咳，但有典型表现的患者较少见，不典型的轻症患者更为多见。由于缺少实验室诊断条件等原因，这些不典型患者很难获得及时诊断，常被误诊或漏诊[2]。国内多地血清学流行病学调查结果也提示百日咳发病在我国并不少见，年均报告发病率已由2009年的0.12/10万上升至2019年的2.15/10万[7]，且存在严重的误诊和漏诊现象[8-11]，尤其在实验室检测条件有限的基层单位更是如此。

没有获得及时诊断和治疗的百日咳感染者是重要的传染源，也是百日咳难于有效防控的根源。尤其是在基层医院建立快速准确的诊断方法，对于提高百日咳的诊断率、及时防控和治疗尤为重要。百日咳感染后可出现血清PT-IgG升高，一般取疑似患者急性期与恢复期两份血清标本，当后者抗体滴度比前者升高≥4倍时具有诊断意义[1]。但临床上往往不能获得双份血清，因此目前多数国家采用特定的PT-IgG界值进行单份血清检测。但对于单次血清学诊断百日咳的检测方法和阈值等问题，国际上并没有统一标准，不同国家和地区采用的界值有所不同，如30、50、100和125 IU/ml[12-17]。根据本课题组前期国内人群百日咳免疫水平的评估结果[18-19]和检测试剂盒的说明，本研究中的胶体金试纸条，采用20 IU/ml作为百日咳免疫保护界值，80 IU/ml作为百日咳感染的诊断界值(疫苗接种超过1年)。

ELISA法是检验血清PT-IgG抗体水平的确诊依据。本研究以ELISA法为参照标准，界值为20 IU/ml的胶体金检测阳性预测值(95.2%)和特异度(95.7%)较高，有助于明确PT-IgG抗体水平>20 IU/ml的群体；不足的是，对>20 IU/ml的标本存在一定的漏检，敏感度仅有76.2%。因此，对于检测阴性的对象，需进一步采用ELISA方法确认其水平。而界值为80 IU/ml的胶体金检测的阴性预测值和敏感度高(均为100.0%)，特异度(69.9%)和阳性预测值(30.3%)低，有助于判断无百日咳感染，可用于排除百日咳感染；不足的是误诊率高，故对于检测阳性的患者，需进一步检测其抗体浓度水平或联合其他检测方法以降低误诊率。以ELISA检测结果为标准，两种界值胶体金检测方案的约登指数均为0.7，达到中等水平，如果能进一步完善其技术和产品，提高约登指数，将更有利于临床应用和推广。同时，可考虑开发并评估其他检测界值的胶体金试纸条，从而将检测结果定位到更为具体的数值范围，提高检测准确性。临床应用过程也可以考虑评估动态变化，以辅助临床诊断的价值。

综上所述，以ELISA法为参考标准评价胶体金法检测PT-IgG水平，检测界值为20 IU/ml的胶体金法检测的特异度和阳性预测值较高，阳性结果较为可靠，表明机体有一定水平的百日咳免疫；检测界值为80 IU/ml的胶体金检测的敏感度和阴性预测值较高，结合临床可用于排除百日咳急性或近期感染。另外，胶体金试纸条检测操作简便快捷，更适合在一些条件相对较差的基层医院推广使用。但目前胶体金法检测的准确性还需进一步提高，有些结果需要一步检测浓度水平，但这并不影响其作为国内临床评估百日咳免疫水平和诊断百日咳的重要替代方法。

志谢本研究中使用的胶体金试纸条由武汉生命科技股份有限公司制备，并无偿提供，在此表示感谢！

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献胡亚红和刘丹丹：设计实验、采集数据、统计分析、论文撰写和修改；高薇：统计分析；孟庆红：解释数据；姚开虎：指导论文修改