通络明目膏对糖尿病视网膜病变大鼠微血管的保护作用及其作用机制研究

陈丽华 凌梓韵▲ 李霭燕 吴小桃

1.广州市番禺区中医院眼科，广东广州 511400；2.广州市番禺区中医院药学部，广东广州 511400

糖尿病视网膜病变为临床常见的糖尿病慢性并发症，也是当前导致成年人失明的主要原因之一。糖尿病视网膜病变的早期表现为视网膜形成血管瘤、渗血等[1]，病情进展到中晚期可出现新生血管、视网膜脱离[2]，给患者的生活带来严重不良影响。近年来有研究报道[3-4]，微血管损伤为糖尿病视网膜病变的主要病理基础，微血管损伤可导致视网膜出血、渗出，进而诱发视网膜病变发生发展。因此，减轻或阻止视网膜微血管损伤是防治糖尿病视网膜病变的主要措施。通络明目膏为广州市番禺区中医院（我院）中药房自拟方组成的新膏方，有活血化瘀、通络明目、益气养阴的功效，目前尚处于研究阶段，其在糖尿病视网膜病变发生发展过程中的防治作用还有待研究。为此，本研究开展动物实验，以探究通络明目膏对糖尿病视网膜病变的防治作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60例SD大鼠，属于无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级别，鼠龄约为6周，生产批号：20200923，雌雄各半，体重 180～ 250 g，平均（213.02±20.41）g，均饲养于广州中医药大学动物实验中心（许可证号：NO.44005800005550）。所有大鼠均适应性喂养7 d，再应用随机数表法将其分为空白组、阳性对照组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组，每组各10只大鼠。实验过程中动物处置均符合动物伦理标准（审批号：2020089）。

1.2 药物和试剂

通络明目膏（由三七10 g、黄芪15 g、丹参12 g、玄参 12 g、葛根 20 g、陈皮 6 g、茯苓 20 g、瓜蒌 12 g、法半夏 6 g、熟地黄 20 g、生地黄 20 g、山药 20 g、山萸肉10 g、泽泻 12 g、牡丹皮12 g、柴胡12 g、当归5 g、五味子5 g、党参 15 g、麦冬 15 g、菊花 15 g、青葙子15 g、决明子 15 g、谷精草 15 g、茺蔚子 15 g、山楂5 g、鸡血藤20 g、黄明胶2g、龟甲胶2 g所组成）由我院药学部提供。羟苯磺酸钙胶囊（北京京丰制药，国药准字H20010795，规格：0.5 g/粒），实验时用蒸馏水将上述药物配制成实验所需浓度的溶液。鼠抗兔血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）单克隆抗体（美国Abcam公司，产品编号：ab28775）、鼠抗兔血管内皮细胞生长因子受体 2：（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）单克隆抗体（美国Abcam公司，产品编号：ab2349）。

1.3 方法

1.3.1 构建糖尿病视网膜病变大鼠模型 阳性对照组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组以高脂高糖饲料（购自北京科澳协力饲料有限公司）饮食联合注射2%链脲佐菌素溶液（北京索莱宝科技有限公司，规格：100 mg/支）建立糖尿病视网膜病变大鼠模型[5]，具体方法：上述5组大鼠予以高脂高糖饲料喂养5周，随后禁食12 h，经大鼠腹腔注射60 mg/kg链脲佐菌素[用0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，规格：100 ml/瓶）配制]。72 h后采集其尾静脉血测定其空腹血糖，若大鼠的空腹血糖＞16.7 mmol/L，说明糖尿病大鼠模型建模成功。与此同时继续予以高脂高糖饲料喂养，并每日对大鼠进行眼底镜检查，若见大鼠视网膜持续1周均存有血管瘤、毛细血管扩张，说明糖尿病视网膜病变模型构建成功。空白组大鼠在实验过程中予以普通饲料，正常饮食水。

1.3.2 给药干预 按人-大鼠体表面积比值折算大鼠的等效剂量，中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组的对应剂量分别为 10、40、60 mg/（kg·d），为临床等效剂量的0.5、1、3倍，蒸馏水配制灌胃；阳性对照组羟苯磺酸钙胶囊剂量为100 mg/（kg·d），蒸馏水配制灌胃；模型组和空白组予以等体积生理盐水灌胃。每日灌胃相应药物1次，持续灌胃干预12周。

1.4 检测指标

1.4.1 HE染色观察视网膜组织形态结构 给药结束后每组随机选择3只大鼠，以断头法将大鼠处死，取大鼠的眼球组织，制作为石蜡切片。常规进行脱蜡、HE染色后在显微镜下计数视网膜血管周细胞数、血管内皮细胞数。

1.4.2 伊文思蓝（evans blue，EB）渗漏实验观察大鼠血-视网膜屏障通透性 给药结束后每组随机选取3只大鼠，以断头法将大鼠处死，取出大鼠眼球将其视网膜组织分离出来。经漂洗、孵育、离心处理后用紫外分光光度计测定吸光度值，计算差值，以视网膜干重标准化EB含量描述血-视网膜屏障通透性。

1.4.3 视网膜组织VEGFR-2、VEGF表达量测定 采用免疫组化染色法检测。药物干预后以断头法处死每组剩余4只大鼠，取出眼球，制作为石蜡切片。经孵育、封闭、滴加一抗、二抗、显色、复染、封片处理后，应用Image-Pro Plus图像分析软件视网膜组织的累积光密度（integrated optical density，IOD）值，用于反映视网膜VEGFR-2、VEGF表达量。

1.5 观察指标

①比较各组大鼠视网膜血管周细胞数、血管内皮细胞数；②比较各组大鼠视网膜组织EB渗透量；③比较各组大鼠视网膜组织VEGFR-2、VEGF的IOD值。

1.6 统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠视网膜血管周细胞数、血管内皮细胞数比较

中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、阳性对照组、模型组的视网膜血管周细胞数低于空白组，血管内皮细胞数高于空白组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、阳性对照组大鼠视网膜血管周细胞数高于模型组，血管内皮细胞数低于模型组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。中药低剂量组与阳性对照组的视网膜血管周细胞数、血管内皮细胞数比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。中药高剂量组视网膜血管周细胞数高于中药低剂量组、中药中剂量组，血管内皮细胞数低于中药低剂量组、中药中剂量组，呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表1。HE染色镜检见图1。

表1 各组大鼠视网膜血管周细胞数和血管内皮细胞数比较（个，x ± s）

图1 镜检下各组大鼠视网膜细胞排列情况（HE染色，200×）

2.2 各组大鼠视网膜组织EB渗透量比较

空白组大鼠视网膜EB渗透量为（4.07±0.21）ng/mg，模 型 组 为（24.94±1.23）ng/mg，阳性对照组为（14.47±0.84）ng/mg，中药低剂量组为（16.87±2.28）ng/mg，中药中剂量组为（11.45±1.43）ng/mg，中药高剂量组为（8.24±0.79）ng/mg，多组间比较差异有统计学意义（F=93.716，P=0.000）。中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、阳性对照组、模型组的视网膜组织EB渗透量高于空白组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、阳性对照组的EB渗透量低于模型组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。中药高剂量组、中药中剂量组的EB渗透量低于中药低剂量组、阳性对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。中药低剂量组与阳性对照组的EB渗透量比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

2.3 各组大鼠视网膜组织VEGFR-2、VEGF的IOD值比较

空白组的视网膜组织VEGFR-2、VEGF的IOD值显著低于其他组别（P＜ 0.05）。中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组视网膜组织中VEGFR-2、VEGF的IOD值显著低于模型组（P＜ 0.05）。中药高剂量组的 VEGFR-2、VEGF 的IOD值明显低于阳性对照组（P＜ 0.05）。阳性对照组与中药低剂量组、中药中剂量组的视网膜组织VEGFR-2、VEGF的IOD值比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05），见表2。

表2 各组大鼠视网膜组织VEGFR-2、VEGF的IOD值比较（x ± s）

3 讨论

糖尿病视网膜病变的病理特征主要是视网膜血管微循环障碍，具体表现为视网膜组织血流动力学及血液流变学改变[6]。糖尿病患者机体长期处于高血糖水平，易导致视网膜的血-视网膜屏障受损，促使血小板活化凝聚，进而影响视网膜血液流变学，造成视网膜毛细血管狭窄堵塞，出现视网膜无灌注区。随着视网膜微循环障碍程度加重，视网膜血管周细胞逐渐丢失，由于血管周细胞与血管内皮细胞紧密接触，故周细胞丢失可促使内皮细胞变薄，或导致其增殖、分化、迁移，诱使新生血管形成[7-8]。由此可见，保护视网膜血管周细胞是糖尿病视网膜病变治疗的关键。

中医学认为，糖尿病视网膜病变与“消渴”密切相关，病机以气阴虚为本，痰浊瘀血为标[9]。通络明目膏是我院的院内制剂，其方中熟地黄、山萸肉、黄明胶、龟甲胶、麦冬、五味子、泽泻滋养肝肾之阴，清泻虚火；茺蔚子、三七、丹参、当归、鸡血藤、山楂活血化瘀通络；党参、黄芪、山药、茯苓健脾益气；生地黄、玄参、牡丹皮清热养阴；决明子、菊花、青葙子、谷精草清热明目退翳；葛根、柴胡、陈皮理气升发清阳，引药上行，药达病所；瓜蒌、法半夏化痰散结。诸药配伍发挥活血化瘀、通络明目、益气养阴的作用。

在胚胎血管成熟过程中，周细胞被认为决定着血管从新生到成熟的过程，其可通过多种细胞因子途径被募集到新生的血管周围，改善视网膜微循环，但一旦周细胞募集被抑制可引起血管异常重构，故周细胞数量升高提示视网膜血管病变得以改善。与此同时，血管内皮细胞增殖、迁移为新生血管形成的主要环节之一，故视网膜血管内皮细胞数量减少能够有效抑制新生血管生成。此外，有研究指出，通过检测视网膜血管内EB含量，可利用EB的特性比较精确地衡量早期糖尿病大鼠视网膜病变中血-视网膜通透性改变情况，故EB含量越低，提示视网膜血管渗漏下降。本研究对实验大鼠予以通络明目膏干预，结果显示，中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、阳性对照组大鼠视网膜血管周细胞数显著高于模型组，且血管内皮细胞数、EB渗透量显著低于模型组（P＜ 0.05），与陈茜等[10]研究相符，证实通络明目膏可有效改善糖尿病视网膜病变大鼠视网膜微循环，保护视网膜周细胞，减少血管渗漏，进而抑制新生血管形成，使其对视网膜病变有良好的防治作用。

VEGF及其受体是在糖尿病视网膜病变毛细血管增生机制中起着关键作用的生长因子[11]，其作用主要是促进新生血管形成和提高血管通透性，是当前临床研究中已知极强的内皮细胞通透性增强剂[12]。相关研究报道[13-14]，VEGF及其受体表达水平与糖尿病视网膜病变的病程呈正相关，随着糖尿病视网膜病情加重，视网膜增殖变化更为显著，VEGF/VEGFR-2表达水平最值升高。另有文献指出[15]，VEGF与VEGFR-2有协同作用，收缩血管作用显著，可诱导血管内皮细胞增殖，血管完整性受到破坏。本研究中，空白组的视网膜组织VEGFR-2、VEGF的IOD值显著低于其他组别，但中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组视网膜组织中VEGFR-2、VEGF的IOD值显著低于模型组，与秦裕辉等[16]研究结果相似，进一步说明糖尿病视网膜病变大鼠视网膜VEGFR-2、VEGF呈高表达，而通络明目膏可能通过下调VEGF、VEGFR-2水平，进而抑制其相互作用，改善微循环障碍，进而对视网膜微血管损伤发挥修复作用。与此同时，本研究还发现中药高剂量组的大鼠视网膜血管周细胞数显著高于阳性对照组，血管内皮细胞数、EB渗透量以及VEGFR-2、VEGF的IOD值显著低于阳性对照组，提示通络明目膏对糖尿病视网膜病变大鼠的微血管保护作用呈一定的量效关系，且剂量愈高，其对大鼠视网膜微血管的改善及保护作用就愈强，这可为临床应用通络明目膏用量提供参考。但本研究存在样本量少、未对通络明目膏安全性进行研究等不足之处，故今后需扩大样本量，增加观察指标，进行更高水平层次探讨通络明目膏量效关系及其作用机制，为临床推广应用提供高质量循证医学证据。

综上所述，通络明目膏可对糖尿病视网膜病变大鼠微血管发挥良好的保护作用，有效改善大鼠视网膜微血管形态学及通透性，且该保护作用具有一定的量效关系，其作用机制可能与下调VEGFR-2、VEGF表达有关。