血流感染肺炎克雷伯菌临床特征、毒力基因及分子流行病学研究

杭修兵 肖晓 储雯雯 叶乃芳 刘周

(安徽医科大学第二附属医院检验科，合肥 230601)

血流感染是指由细菌、真菌等病原体入侵血流所致的全身性感染，属于临床重症感染性疾病[1]。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KPN)属于肠杆菌目克雷伯菌属，是导致医院和社区感染的主要病原菌之一[2-3]。随着广谱抗菌药物的滥用，碳青霉烯耐药KPN(carbapenem-resistance KPN,CRKP)检出率呈逐年上升趋势，使得血流感染治疗难度增加[4]。近年来CRKP不仅表现为多重耐药，而且通过获得毒力质粒进化为高毒力、高耐药性菌株，使得临床感染蔓延趋势更为严重[5-6]。研究表明，社区与院内血流感染KPN在临床特征、毒力因子以及分子生物学特征上存在一定差异，对其进行相关监测具有重要临床意义[7]。本研究回顾性分析安徽地区某省级综合性三级甲等医院2019年1月至2020年12月住院患者送检血液标本中KPN的临床特征和耐药情况，并对其毒力基因和相关分子生物学特征进行研究分析，以期为血流感染KPN的临床诊治和耐药防控提供相关依据。

1 资料与方法

1.1 病例资料

收集2019年1月至2020年12月安徽地区某省级综合性三级甲等医院的临床血流感染患者血培养分离的91株KPN(剔除重复菌株)。本研究纳入标准为住院血流感染患者中至少一次血培养分离出KPN，并达到血流感染的诊断标准[8]；同时排除标准为：① 病史资料不全，② 患者年龄＜14岁，③ 两种及以上细菌混合感染。最终共计72株KPN纳入本研究，同时收集对应住院患者主要临床资料，包括年龄、性别、入住ICU天数、基础疾病、接受侵袭性诊疗操作与发生KPN血流感染前使用碳青霉烯类药物情况、患者临床转归。根据临床感染类型分组，其中感染发生入院48 h后为医院血流感染(hospital-acquired bloodstream infection,HABSI)组，感染发生于入院4 8 h以内为社区血流感染(community-onset bloodstream infection,COBSI)组[9]。研究通过本院伦理委员会审查同意(批准号：PJ-YX2018-001)。

1.2 菌株鉴定及药敏试验

常规传统方法培养纯化细菌，应用德国Bruker-Microflex LT型质谱仪进行菌种鉴定，应用法国BioMérieux Vitek-2型全自动分析仪进行药敏试验，结果判定参照CLSI 2019版标准[10]。采用微量肉汤稀释法测定多黏菌素B的(minimum inhibitory concentration,MIC)MIC值，结果按EUCAST标准判定(http://www.eucast.org)。CRKP的判定标准为对亚胺培南、美罗培南及厄他培南3者任意一种耐药的KPN。应用改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)及EDTA改良灭活试验(eCIM)检测CRKP菌株的碳青霉烯酶表型[10]。

1.3 多位序列分型、荚膜血清型及毒力基因检测

应用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)进行KPN的序列分型检测，扩增包括gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB在内的7个标准的管家基因，扩增条件及方法参见文献[11]，扩增产物测序后确定等位基因，应用MLST网站进行序列类型(sequence type，ST)鉴定。将等位基因gapA-infBmdh-pgi-phoE-rpoB-tonB按顺序整理，并根据其差异将ST型分为单个位点变异型(single-locus variants,SLVs)、双位点变异型(double-locus variants,DLVs)及三位点变异型(triple-locus variants,TLVs)。应用goeBurst软件建立最小生成树，确定ST型中的克隆群主型(group founder,GF)及亚克隆群主型(sub-group founder,sub-GF)[12]。

应用PCR方法检测了10种毒力相关基因，包括iucA、allS、iroB、kfu、mrkD、rmpA、rmpA2、ureA、wabG和ybtS，PCR引物及扩增条件参见文献[13]。应用PCR联合测序技术检测KPN菌株荚膜wzi分型，PCR引物及扩增条件参见文献[14]。

1.4 全基因组测序及生物信息学分析

应用Illumina NovaSeq测序仪对CRKP菌株进行全基因组测序，测序结果应用在线数据库(http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgi)分析毒力基因；应用Resfinder和PlasmidFinder分析耐药基因及质粒特征。应用在线服务器(https://cge.cbs.dtu.dk/services/CSIPhylogeny/)分析单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)，然后将结果导入软件FigTree 1.4.3，生成最大似然树。

1.5 统计学分析

应用WHONET5.6软件对药敏结果进行分析，其他统计分析应用SPSS 21.0软件。应用χ²检验进行两组间率的比较，以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 临床感染特征分析

72例KPN血流感染患者中，54.2%为HABSI组(39例)，45.8%为COBSI组(33例)。两组患者在年龄、性别及基础疾病方面均无显著差异(P＞0.05)。HABSI组患者入住ICU天数＞10d比例高于COBSI组(P＜0.05)。在发生血流感染前，HABSI组患者接受侵入性操作及使用碳青霉烯类药物的比例也显著高于COBSI组(P＜0.05)。比较临床预后可见，HABSI组患者治愈或好转的比例显著低于COBSI组(P＜0.05)。具体临床特性见表1。

表1 HABSI组和COBSI组患者的临床特征比较Tab.1 Comparison of clinical characteristics between HABSI group and COBSI group

2.2 抗菌药物敏感性实验

药敏试验结果显示，72株KPN对头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均在34.7%～48.6%，亚胺培南、美罗培南和厄他培南的耐药率均为26.4%，替加环素耐药率为1.4%，未检出多黏菌素B的耐药株。HABSI组KPN对亚胺培南、美罗培南和厄他培南的耐药率均为48.7%，而COBSI组未检出碳青霉烯耐药菌株。除多黏菌素B和替加环素外，HABSI组KPN对抗菌药物耐药率均显著高于COBSI组(P＜0.05)。结果见表2。

表2 HABSI和COBSI组的KPN对抗菌药物耐药率Tab.2 The resistance rates of KPN with HABSI group and COBSI group

2.3 分子分型及毒力基因检测

MLST结果显示，HABSI组包含23种ST型，其中ST11型16株(41.0%)、ST15型2株(5.1%)，其余ST1、ST14、ST17、ST39、ST65、ST101、ST107、ST218、ST220、ST234、ST307、ST334、ST592、ST906、ST1386、ST1496、ST1630、ST1699、ST1803、ST1899及ST2494各1株(各占2.56%)。COBSI组中包含24种ST型，其中ST23型4株(12.1%)，ST86型3株(9.1%)，ST25、ST65、ST231及ST412各2株(6.1%)，ST14、ST17、ST20、ST37、ST163、ST200、ST276、ST307、ST380、ST511、ST586、ST595、ST611、ST661、ST685、ST1627、ST1786及ST1798各1株(各占3.03%)。

GoeBURST分析显示，HABSI组中ST220为GF，ST11、ST65和ST39等为sub-GF，ST15和ST1630为ST11的TLVs；COBSI组中ST23为GF，ST511、ST65和ST412为sub-GF，ST163为ST23的SLV，ST17、ST25和ST276均为ST23的DLVs，见图1。

图1 HABSI组菌株(A)与COBSI组菌株(B)ST型的goeBURST分析图Fig.1 GoeBURST analysis of HABSI group and COBSI group isolates’ sequence type

荚膜分型显示，HABSI组菌株中38.5%为K64型，K125、K19和K57型分别占10.3%、5.1%和5.1%，COBSI组菌株荚膜型中K2、K1和K57分别占21.2%、12.1%和6.1%，见表3。

表3 HABSI组和COBSI组荚膜分型及毒力因子分析Tab.3 Capsular serotype and virulence factor analysis of HABSI group and COBSI group

毒力基因分析显示，pLVPK-like毒力质粒相关的毒力因子rmpA、rmpA2以及iucA在HABSI组和COBSI组携带率分别为56.4%、61.6%、46.2%与30.3%、48.5%和33.3%。

2.4 CRKP全基因组测序分析

共检出19株CRKP，根据其分离的先后顺序，将19株CRKP依次命名为CRKP 01～19。mCIM及eCIM试验显示，所有CRKP菌株mCIM试验均为阳性，5.3%(1/19)菌株eCIM试验阳性。Resfinder分析显示，上述eCIM试验阳性菌株(1株，5.3%)携带blaNDM-1，其余mCIM阳性CRKP(18株，94.7%)携带blaKPC-2。所有CRKP均携带超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamase,ESBL)基因，包括blaCTX-M-65(73.7%)、blaSHV-12(84.2%)和blaTEM-1(78.9%)等。耐药基因tet(A)和fosA携带率为84.2%和68.4%。

分子分型结果显示，84.2%(16/19)的CRKP属于ST11型，且K64为ST11-CRKP主要荚膜型(15株，93.8%)，SNP分析显示所有ST11-CRKP具有高度亲缘关系。PlasmidFinder分析显示，CRKP携带IncF11、IncR及IncHI1B型质粒的比例分别为94.7%(18/19)、78.9%(15/19)及63.2%(12/19)。其中携带IncHI1B型质粒的CRKP均属于K64-ST11型，其rmpA、iucA和rmpA2基因携带率分别为100%(12/12)、91.7%(11/12)和91.7%(11/12)。见图2。

图2 CRKP相关耐药基因、毒力基因及质粒分布情况Fig.2 Distribution of resistance genes,virulence genes and plasmids in 19 CRKP isolates

3 讨论

KPN是临床血流感染的常见病原体，随着碳青霉烯类抗生素在临床广泛使用，KPN的耐药趋势不断上升。研究表明，医院感染与社区感染KPN对抗菌药物的耐药性有一定的差异，医院获得性血流感染KPN菌株常常携带多种耐药基因，呈现多重耐药表型，导致患者住院时间增加、病死率升高，给临床抗感染治疗带来极大挑战[15-16]。本研究72例患者中医院获得性占54.2%(39例)，且临床预后医院组比社区组患者差，与上述报道基本一致。

ICU是易发生血流感染的主要科室之一，这与ICU患者住院周期长、病情危重以及长时间或大剂量使用抗生素等特点有关[17]。本研究数据显示，HABSI组患者入住ICU天数＞10d比例高于COBSI组，入住ICU天数的延长可能会增加HABSI的感染风险。在侵入性治疗方面，发生KPN血流感染前进行侵袭性诊疗操作患者的比例HABSI组显著高于COBSI组。研究表明，对于侵袭性诊疗操作，如置管、穿刺、气管插管等有创操作更容易引起HABSI[18]。因此，在进行院感防控时，应重点关注ICU病区，增强医务人员的无菌操作观念，以防多重耐药菌通过手部污染物体表面。同时临床和院感部门应尽量加强侵入性操作的评估，掌握合理的拔管指征。

药敏试验结果显示，除多黏菌素B和替加环素外，HABSI组KPN对抗菌药物耐药率均显著高于COBSI组，其中HABSI组菌株对碳青霉烯类抗生素的耐药率高达48.7%，值得临床高度关注。进一步对HABSI组的CRKP菌株进行耐药基因分析可见，所有CRKP均携带包括碳青霉烯耐药基因在内的多个耐药基因。质粒分析提示CRKP都携带了一个或多个质粒复制子，其中以IncFII和IncR为主。研究表明，IncFII和IncR质粒通常携带不同的耐药基因，并且可以在医院环境中传播，从而造成多重耐药菌株的播散[19]。HABSI组在发生KPN血流感染前使用过碳青霉烯类药物的比例明显高于COBSI组，提示碳青霉烯类药物的过度使用可能会增加CRKP菌株产生的风险。因此，临床科室、药学部门及医院感染管理部门应高度重视，规范使用抗菌药物，采取严格的消毒隔离措施，避免KPN多重耐药菌株的产生与传播。

本研究中84.2%的CRKP为ST11型，该类型是中国地区CRKP的主要流行克隆群[16]。通过荚膜分型，ST11型可分为K47-ST11及K64-ST11两个亚克隆型，而近年来K64-ST11型CRKP逐渐取代了K47-ST11型，成为临床主要流行的亚克隆[20]。本文中，K64-ST11亚克隆型检出比例高达93.8%，同时SNP分析显示其具有高度的亲缘关系，提示该亚克隆型可能存在医院内感染播散；且HABSI组菌株多种质粒介导的毒力因子(如rmpA、rmpA2和iucA等)阳性率较高，同时HABSI组中CRKP菌株携带IncHI1B型质粒的比例高达63.2%。IncHI1B型质粒是KPN菌株中pLVPK-like毒力质粒的主要分子型别，该型质粒中常携带了包括rmpA、rmpA2、iucA及ybtS等在内的多种毒力质粒。毒力质粒pLVPK-like被认为是高毒力KPN(hypervirulent KPN，hvKP)的关键分子标志，一般情况下由K1-ST23型及K2-ST86型hvKP天然携带[21]，这也提示本地区已经存在携带IncHI1B型pLVPK-like毒力质粒CRKP菌的医院感染流行趋势，应加强防控。

由于纳入研究的菌株及病例数量较少，使得本研究存在一定的局限性，需进一步对KPN进行广度和深度及多部门的协作研究，后续将继续收集临床分离菌株，密切监控血流感染中K64-ST11型CRKP菌株的流行趋势，为制定相应的感染控制措施，防控多重耐药菌的院内传播流行提供参考数据。