杜仲叶指纹图谱的建立及化学模式识别

申梦园，吴蓓，段涵琪，李玉玲，陈鸿平，刘友平

(1.西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611130；2.成都中医药大学 药学院，四川 成都 611130)

杜仲叶为杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥叶，《中国药典》(2005版)首次收载入药，与杜仲皮相似，具有补肝肾，强筋骨的功效[1-2]。杜仲叶主要成分为酚酸类、黄酮类以及环烯醚萜类等[3]。《中国药典》(2020版)以绿原酸为杜仲叶质量控制指标性成分；此外杜仲叶中含有丰富的黄酮类成分，闫建昆等[4]从杜仲叶中分离得到圣草素等13个化合物，严颖等[5]人研究发现，杜仲叶中黄酮类成分含量高于其他部位；杜仲叶中的环烯醚萜类成分主要有杜仲醇、京尼平苷酸等[6]。目前，我国杜仲产业中作为药用的杜仲皮全国推广达到了95%[7]，与杜仲皮相比，杜仲叶可再生能力强，随着杜仲以叶代皮的深入研究[8]，目前市场上以杜仲叶为原料的产品多种多样，主要有杜仲叶饲料添加剂[9]、杜仲茶[10]、杜仲降压片[11]等，杜仲叶的开发有十分广阔的推广空间和前景。目前已有杜仲叶指纹图谱的相关报道[12]，近年来化学模式识别技术在中医药领域已被广泛应用[13-16]，本文拟在建立杜仲叶指纹图谱的基础上结合化学模式识别技术对17批杜仲叶药材成分的差异性进行分析，以期为杜仲叶综和开发利用提供基础。

1 实验仪器与材料

1.1 主要仪器

1260型高效液相色谱仪(美国Agilent Technologies有限公司)；UPTUO-I-1000TE超纯水制备仪(成都超纯科技有限公司)；BT125D型十万分之一电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 材料

绿原酸(批号：CHB190121)、异槲皮苷(批号：CHB180628)、芦丁(批号：CHB190110 )和紫云英苷(批号：CHB181115)均购自成都克罗马生物科技有限公司，各对照品纯度均大于98%。乙腈(美国Fisher chemical，色谱纯)；超纯水(实验室自制)；甲醇(北京化工厂，分析纯)。杜仲叶样品经成都中医药大学严铸云教授鉴定为杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥叶(见表1)。

表1 杜仲叶样品采收信息

2 实验方法与结果

2.1 供试品溶液制备

精密称定杜仲叶粉末1 g(过三号筛)，加 50%的甲醇 35 mL至锥形瓶中，于 100℃加热回流提取1 h，后补足失重，滤过，吸取上清液，后过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.2 混合对照品溶液制备

称取绿原酸1.01 mg、芦丁0.24 mg、异槲皮苷0.66 mg、紫云英苷 0.23 mg，加50%甲醇定容至10 mL容量瓶，即得。

2.3 色谱条件

在唐芳瑞[12]等人考察的基础上进一步优化，Agilent C18柱(4.6×250 nm，5 μm)；流动相0.1%磷酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脱，0-6 min：7%～14% B，6-30 min：14%～30% B，30-35 min：30%～70% B，流速0.8 mL/min；柱温 30℃；进样量10 μL；检测波长360 nm。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

取混合对照品溶液，采用“2.3”项条件下条件连续进样6次，结果表明，在上述条件下混合对照品溶液保留时间的RSD均小于0.3%，峰面积的RSD均小于2%，表明该仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验

取S1样品6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”色谱条件下进样。以10号峰异槲皮苷为参照峰，计算14个共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果显示，共有峰相对保留时间的RSD均小于0.3%，相对峰面积的RSD均小于2.5%，表明该仪器重复性良好。

2.4.3 稳定性考察

以S1样品为考察对象，参照 “2.3”所示的色谱条件分别在0、1、2、4、8、12 h进样。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.5%，相对峰面积的RSD均小于1.5%，结果表明该仪器稳定性良好。

2.5 指纹图谱相似度评价

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》(2012.130723版)建立指纹图谱。选取S1为指纹图谱的参照图谱，采用平均数法，时间窗设为0.1 min，多点校正，得到17批杜仲叶指纹图谱及对照指纹图谱(见图1)，确定共有峰为14个，并进行相似度计算，从软件分析得出似度结果(见表2)。

表2 17批杜仲叶相似度结果

图1 17批杜仲叶(S1-S17)的HPLC指纹图谱叠加图及对照图谱(R)

2.6 共有色谱峰指认

通过与对照品比对，指认出了4个共有峰，分别为绿原酸(3号峰)、芦丁(7号峰)、异槲皮苷(10号峰)和紫云英苷(13号峰)，共有峰的指认结果见图2。

a 绿原酸对照品 b 芦丁对照品 c 异槲皮苷对照品 d紫云英苷对照品

2.7 化学模式识别分析

2.7.1 聚类分析

应用SPSS 24.0软件，以共有峰的峰面积为变量，采用系统聚类法结合欧氏距离作为样品的测度，可直观地分析不同组样本差异。其树状图结果见图3。当欧式平方距离d=25 s时，17批杜仲叶聚为两类。Ⅰ类为四川省通江县(S3)和四川省凉风村(S11)均为矮林杜仲叶。Ⅱ类包括其他产地(S1、S2、S4-S17)均为乔林杜仲叶。从图3聚类分析结果来看，栽培方式可能是杜仲叶品质存在差异的因素之一。

图3 17批杜仲叶聚类分析

2.7.2 主成分因子分析

采用SPSS 24.0统计分析软件将共有峰面积标准化处理后，以主成分的特征值大于1和贡献率为依据，进行主成分因子分析。根据因子分析结果可得总方差解释表(见表3)和碎石图(见图4)。共得到2个主成分因子，特征值分别为10.243、1.270，两个主成分因子方差贡献率分别为73.166%，9.072%共包含14个共有峰中82.238%的信息，因此可以通过提取的2个主成分对17批杜仲叶样品进行综合评价。

表3 杜仲叶2个主成分因子总方差解释变异

图4 碎石图

以Y1，Y2两个主成分代表共有峰的主要信息，建立杜仲叶品质综和评价模型，共有峰与主成分之间的相关性表达式如下所示：Y1=-3.54×F1-4.31×F2+8.53×F3-2.72×F4-0.44×F5-0.04×F6+0.76×F7-0.11×F8+0.57×F9+0.23×F10+3.06×F11-3.98×F12-1.82×F13+2.73×F14+1.21×F15+1.75×F16-1.89×F17；Y2=-1.21×F1-0.89×F2-0.85×F3-2.36×F4+1.54×F5+0.92×F6+2.02×F7+1.62×F8+1.32×F9-0.46×F10-0.52×F11+0.26×F12+0.26×F13-2.23×F14-1.82×F15+2.11×F16+0.31×F17；结合1，2主成分方差贡献率，得杜仲叶质量综合评价表达式：Y综合得分=(Y1×73.166+Y2×9.072)/82.238，杜仲叶品质综合评价得分按照此表达式进行计算，分高则排名靠前，表明杜仲叶的品质越优。结果见表4。

表4 综合得分及排名

结合旋转成分矩阵(表5)和旋转后载荷图(图5)分析可知F2-F14在Y1上的贡献最大，F1在Y2上的信息贡献最大。

表5 旋转后因子负荷矩阵

图5 旋转后共有峰载荷图

上述综和排名及聚类分析结果表明，四川省通江县和四川省凉风村(S3、S11)品质明显优于其他产地。

2.7.3 主成分分析

将各样品共有峰峰面积导入SIMCA14.1软件，通过主成分分析(PCA)来初步判断各样品的聚集情况。PCA模型中R2X=0.918，Q2=0.755，由PCA得分图可看出，S3和S11明显聚为一类，其余产地的杜仲叶聚为一类。结果见图6。

图6 PCA得分图

2.7.4 正交偏最小二乘法判分析

将指纹图谱中所得到的样品共有峰峰面积导入SIMCA14.1软件，OPLS-DA拟合的模型R2X=0.878，R2Y=0.906，Q2=0.537，均>0.5可以作为17批杜仲叶指纹图谱的模式识别方法。杜仲叶样品OPLS-DA得分图见图7。以VIP>1为存在差异性的标准。结果见图8，从结果可知VIP>1的成分有F3(绿原酸)，F6，F10(异槲皮苷)，F12。

图7 OPLS-DA得分图

图8 OPLS-DA的VIP图

3 讨论

本研究采用HPLC法建立了17批杜仲叶的指纹图谱，方法简便，可重复性强，指纹图谱中各成分吸收强度高、各峰分离度良好且基线平稳。指纹图谱相似度均大于0.899表明17批杜仲叶相似度良好；聚类分析将17批杜仲叶样品分为2大类，其中四川省通江县和四川省凉风村杜仲叶聚为一类，通过主成分因子分析结果进一步证明与其他产地杜仲叶相比较四川省通江县和四川省凉风村杜仲叶质量较优。通过主成分分析及正交偏最小二乘法判别分析筛选出了4个影响杜仲叶药材质量的差异成分，产生这种差异的可能原因有地理及气候条件、采收时间、树的生长年限、栽培模式等多种因素，因此有待于通过是固定采收地点、采收时间、树龄及品种进一步深入研究。本研究在体现药材品质一致性的同时也体现化学成分的差异性，杜仲叶质量控制提供科学参考。本课题尚存在不足，杜仲叶矮林栽培样本来源相对较少，后期有待于利用代谢组学技术，进一步分析乔林及矮林栽培模式下杜仲叶的品质差异，为杜仲叶的合理栽培和利用提供依据。