基于高分辨质谱数据处理策略的中药活性成分体内代谢产物确证的研究进展

李明鉴，杨汉梅，詹固，俞佳，王迪▲

(1.成都中医药大学 医学技术学院，四川 成都 611137；2.成都中医药大学 西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137；3.成都中医药大学 民族医药学院，四川 成都 611137)

中医药作为中华文明和中华民族的瑰宝，其不仅蕴含着中国优秀的传统文化，更为人们的健康保驾护航。习近平总书记讲到：要深入发掘中医药宝库中的精华，更好地推进中医药产业化、现代化，让中医药走向世界[1]。要阐明中医药理论的物质基础，实现中医药现代化，需要明确中药的化学成分和有效组分。然而，目前多数中药的药效物质基础仍不明确。

研究表明，中药的体内代谢产物与其药效物质基础密切相关，对阐明中药的药理活性成分和作用机理、明确其药物生物转化过程、揭示其药物代谢途径和机制具有重要指导意义[2]。由于中药多为复方，其化学成分是一个非常复杂的分子系统，为其活性成分及其体内代谢产物的鉴定带来了巨大挑战[3]，建立一种符合中医药理论的数据处理新策略对于中药活性成分体内外代谢产物的确证研究显得尤为重要。

近年来，随着质谱技术的飞速发展，中药药效物质基础的阐明已有突破性进展，其中高分辨率质谱(High-Resolution Mass Spectrometry,HRMS)不仅具有灵敏度高、检测动态范围宽、化学结构信息鉴定强等特点，而且还可以与色谱技术相结合，更好地实现化学成分的分离与鉴定，可以为中药体内外成分表征提供有力支撑[4-5]。本文将HRMS常用的数据处理策略应用于中药体内外代谢产物检测与鉴定进行系统综述，以期建立一种高效、可靠、准确的符合中医药理论的中药活性成分体内代谢产物确证的新策略。

1 高分辨率质谱(HRMS)介绍

HRMS主要由真空系统、进样系统、离子源、质量分析器、检测器以及数据处理系统几部分构成，其原理与其他类型质谱几无差别，都是先将物质离子化，按照质荷比进行分离，最后通过检测各离子峰强度从而达到检测目的[6-7]，如图1所示。目前常用的高分辨质谱按照质量分析器工作原理主要包括飞行时间质谱、离子阱质谱、磁质谱等；按照离子源工作原理主要有点子轰击质谱、大气压化学电离质谱、快原子轰击质谱等[8]。

图1 质谱仪的仪器构造示意图

与低分辨质谱相比，HRMS能够更加准确地测定前体离子和碎片离子的质量，有利于结构解析；同时，HRMS能够预测它们的化学元素组成，为代谢产物的结构鉴定提供有力支撑。HRMS与色谱联合使用(LC-HRMS)是目前中药体内外代谢产物鉴定的强有力手段，同时亦是用于快速确定已知化合物以及从中药提取物或体内生物样本中鉴定未知化合物的首选方法[7]。鉴于此，本文整理总结了基于HRMS的数据采集和数据处理策略在中药化学成分及其代谢产物识别和鉴定中的解析流程图(如图2所示)。

图2 HRMS的数据采集和数据处理策略在中药化学成分及其代谢产物的识别和鉴定中的解析流程图[25]

2 基于HRMS的中药体内代谢产物鉴别策略

2.1 HRMS结合代谢物预测软件的鉴别策略

代谢物预测软件作为一种靶向鉴别方法，在中药单体成分和中药复杂体系辨识中的应用越来越多，一般与高分辨质谱的数据处理策略结合使用，旨在提高中药化学成分和其代谢物的鉴别效率[9]。常用的代谢物预测软件有Peak view、MetabolitePilot TM、UNIFI等。

许璐等[10]以经典古方开心散类方定志小丸为研究对象，采用 UPLC-Q-TOF-MSE 技术并结合Metabolynx代谢产物分析软件辨识其主要化学成分在抑郁模型小鼠血液、胆汁、尿液、粪便中的代谢产物，结果共鉴定出27个代谢产物，同时亦对体内代谢途径进行系统分析。近年来，黎田儿等[11]为鉴别出白头翁皂苷B7的代谢产物，采用超高效液相色谱-三重四级杆线性离子肼复合质谱法检测大鼠灌胃白头翁皂苷B7后粪便中的代谢产物，结合Peak View 1.2软件进行分子式的拟合,共鉴定了除原型药物及其同分异构体外的23个代谢产物。廖翠平[12]以黄芦木作为研究对象，采用离体粪便温孵法,将正常大鼠的粪菌液与黄芦木提取物在体外37℃恒温厌氧坏境中共同培养,分析黄芦木主成分被肠道菌群孵育24 h后的体外代谢情况,采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术与Peakview数据处理软件对黄芦木化学物质组进行体内外代谢研究。结果从肠道菌群孵育液中检测出了7个代谢产物。袁文琳等[13]基于HRMS结合UNIFI数据分析软件的预测功能，对黄酮类成分马卡因在大鼠体内的代谢产物进行研究。通过大鼠体内代谢和肝微粒共孵育方法，对马卡因在大鼠体内可能的代谢产物和代谢途径进行系统分析，最终从大鼠的血浆、尿液和粪便中鉴定了马卡因经过大鼠口服后在体内代谢的10个产物。

HRMS与代谢物分析软件相结合，可以快速高效地对中药及其复方中的主要化学成分及其代谢产物进行鉴定；但也存在一些弊端，由于中药成分复杂，体内代谢多样化，有时在体内除了一些常规代谢途径外，还可能存在如结构重排，环氧化等特殊类型的代谢反应，常规代谢物预测软件很难对此类化合物进行有效预测[14]。

2.2 提取离子流鉴别策略

提取离子流图(Extracted Ion Chromatogram,EIC)鉴别策略作为一种靶向代谢物鉴别方法，可适用于已知生物转化反应的代谢产物鉴别。研究者可提前建立代谢物数据库(包括精确分子量、前体离子以及碎片离子等信息)，通过设定质荷比范围搜索已建立的数据库化合物在总离子流图中的存在情况，然后通过HRMS采集得到的二级碎片信息进行比对确证[15]。兰薇等[16]采用高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱技术分析了六神丸醇提物的入血成分和代谢产物，通过提取各化学成分的精确质荷比以及二级碎片信息，采用自动对比、对照品对比等方法进行鉴别确认，共鉴定出9个原型入血成分和19个代谢产物。俞洪华[17]等应用UPLC-Q-TOF-MS和提取离子流技术对葛根提取物灌胃给药后的大鼠血清中代谢成分进行比较研究，将空白血清与含药血清的二级碎片离子信息和总离子流图进行对比分析，推测得到25个代谢产物。高霞等[18]考察6种皂苷类成分在离体大鼠肠道菌群内代谢转化的情况,采用LC-Q-TOF-MS/MS对代谢产物进行分析,比较加药孵育样品和空白对照样品的总离子流以及色谱峰的多级碎片离子和准分子离子,分析皂苷类成分在大鼠中可能的代谢产物，最终发现6种皂苷类成分在大鼠肠道菌群作用下发生代谢转化,其中三七皂苷R1被代谢为5个主要产物。

EIC鉴别策略的优势在于能够基本消除内源性物质和其他离子的背景干扰，但是只适用于对已知成分的鉴定，无法发现新的代谢物，且对于研究者来说工作量较大[19]。

2.3 质量亏损过滤技术鉴别策略

高分辨质谱质量亏损过滤技术(Mass Defect Filter,MDF)主要是根据目标成分与类似物具有相近的质量亏损的特点，对采集的数据进行分析处理，可从复杂背景中对中药化学成分和其代谢产物进行鉴定。MDF技术经常用于中药中同类型或相似结构化合物的鉴定，同时也可用于单体化合物体内代谢物鉴定。目前，随着MDF技术的不断发展，已在常规的基础上发展了逐级 MDF 技术、多点筛查 MDF技术、多重 MDF 技术等新技术[20]。

Zhang等[21]采用逐级MDF技术对柑橘中多甲氧基黄酮进行筛选，首先总结黄酮类化合物结构特点，确定分子量范围以及取代基规律，设定质量亏损范围，最终从柑橘中鉴定了81个化合物。高芯等[22]借助质量亏损过滤技术，提取数据中黄酮类成分相关特征离子，通过TOF-MS精确分子量归属各离子的元素组成及离子类型。根据它们的相关性合并推测其可能源自同一个化合物的准分子离子和碎片离子，依据不少于2个准分子离子的出现从而筛选确认出目标化合物。Gao[23]使用了质量缺陷过滤(MDF)和碎片过滤技术处理，对GXSTC粉体中的化合物(体外)以及健康大鼠和心脏病模型大鼠口服后的活性成分(体内)进行了表征。程慧玲等[24]采用高分辨质谱结合多重质量亏损过滤技术(Multiple Mass Defect Filter,MMDF)对大鼠血浆中的大黄素代谢产物进行辨识，首先对可预知的大黄素代谢产物进行提取，然后采用MMDF技术将可预知的代谢产物与大黄素作为模板化合物，通过窄范围过滤对未知的代谢产物进行分析鉴定，结果通过此方法快速鉴定了大黄素的18个代谢物，其中3个为首次发现，为大黄素体内研究提供借鉴。此方法代谢物鉴定流程总结如图3所示。

图3 采用MMDF技术的代谢物鉴定流程

MDF技术在一定程度上可以快速地对中药化学成分的化合物群进行筛选，但是由于中药成分复杂，不同化合物间含量差异较大，因此在筛选代谢物群时，会存在因目标成分含量低，过滤后质谱信号亦较低，最终导致被基线噪音掩盖的缺陷。

2.4 特征离子过滤技术鉴别策略

中药有效组分化合物特征性结构信息主要由特征产物离子或中性丢失分子提供，产物离子过滤(Product Ion Filtration,PIF)和中性丢失过滤(Neutral Loss Filtering,NLF)主要依赖化合物MS/MS谱的有效性和裂解规律相似性识别结构相似的成分[25]。一般是总结中药中代表性成分的质谱裂解规律，进而归纳结构相似类成分共有的碎片离子信息(产物离子或中性丢失)，然后对中药中同类物进行搜索。近年来，许多学者常用此技术来辨识具有相同碳骨架的化学成分，如生物碱类、黄酮类等。

Qiao等[26]通过采用特征离子过滤技术(PIF、NLF)从中药黄芩提取物中鉴定了7种类型共132个化合物，其中59个化合物为首次报道。周慧等[27]采用体外肝微粒体孵育代谢方法结合高分辨质谱特征离子过滤技术建立了马兜铃酸及其体外代谢产物的鉴定方法，结果发现马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ在体外代谢中主要发生硝基还原和去甲基反应，而马兜铃酸产生毒性作用的主要原因就是由于硝基还原反应所产生的马兜铃内酰胺类化合物。此方法对于阐明马兜铃酸的毒理有十分重要意义。Ma等[28]首先对三萜皂苷的裂解途径以及规律进行总结，在此基础上采用特征产物离子和中性丢失过滤技术归纳总结三萜皂苷对照品的裂解规律，进而利用诊断离子、特征产物离子和中性丢失过滤策略，从预知子提取物中共鉴定了 85 种三萜皂苷类化合物。李芳[29]采用UHPLC-Q-TOF/MS鉴定隐绿原酸在大鼠体内的代谢产物。在给予大鼠隐绿原酸后,通过采集血液和粪便进行检测，根据相应的相对分子质量、质谱裂解规律、特征碎片离子以及对照品比对,分析鉴定出47个代谢产物。张立等[30]建立了HPLC-LTQ-Orbitrap的数据采集方法，通过采用特征离子提取的数据处理策略，分析鉴定了大鼠在给药大黄后，在体内的原形成分和代谢产物，从而阐明了大黄体内代谢的机制。

2.5 质谱树状图相似度过滤技术鉴别策略

质谱树状图相似度过滤技术(Mass Spectral Tree Similarity Filter Technique,MTSF)可以在复杂体系中搜索和鉴定低浓度的目标化合物，其检测的基本思路是首先建立质谱树状图数据库(含药物和已知代谢物)，以其为筛选模板，将生物样本检测到的质谱数据与之进行相似度比较，从而挖掘潜在代谢产物[22]。MTSF技术可与MDF技术进行优势互补，为复杂生物基质中快速、准确、全面辨识中药体内药效物质和其代谢产物提供有利手段。金滢等[31]成功运用高分辨质谱多级质谱技术联合MTSF技术，对淫羊藿提取物体内成分和代谢产物进行鉴定，结果从给药后的大鼠血浆、尿液、粪便及胆汁样品中共鉴定了11类112个代谢物。王喆[32]采用MTSF技术对银杏叶提取物在大鼠体内的代谢产物进行鉴定，结果共鉴定了18种原型成分和21种代谢产物，通过对代谢产物的结构类型进行归纳分析，推测出银杏叶提取物在体内发挥药效作用的物质基础。Ying[33]等采用MSTF技术，建立了一种中药体内成分代谢产物鉴定的新策略，在大鼠体内共发现5种黄酮类单体(淫羊藿苷A，淫羊藿苷B，淫羊藿苷C，保活苷I和淫羊藿苷)以及淫羊藿中药提取物中的115种代谢产物，并推测了淫羊藿黄酮的代谢途径。王彩虹[34]采用高效液相色谱-高分辨质谱联用结合MTSF技术对淫羊藿中的5种主要黄酮类成分在大鼠体内代谢产物进行了分析鉴定，并推测出其代谢途径。

与其他技术相比，MTSF技术在发现代谢产物方面优于NLF和PIF技术，可对代谢物进行多模板搜索，从而为代谢物和主要成分之间搭建桥梁，有利于鉴别传统中药复杂的代谢产物；同时此技术亦可对多步生物转化反应生成的未知代谢物进行辨识。但是，在用此技术时的弱点就是需要人为来区分排除假阳性数据，比较费时费力。

2.6 HRMS结合多元统计分析鉴别策略

多元统计分析策略一般包括主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、最小二乘法分析(Partial Least Squares Discrimination Analysis,PLS-DA)、偏最小二乘判别分析(Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis,OPLS-DA)等。PCA能够反应各个组别之间数据离散程度，PLS-DA在加入分组信息后，能够强化组间差异，减少组内差异。通过 OPLS-DA 可对组间差异贡献较大的组分进行有效筛选，在生物样本中可筛查出潜在的代谢物[35]。高分辨质谱所得到的原始数据首先要经过数据处理软件或代谢组学软件进行峰识别、对齐以及与代谢物数据库匹配等标准化处理后，方可导入到多元统计分析软件进行鉴别分析，从而筛选出中药体内代谢物。目前常用的数据处理软件有MAVEN、Compound Discoverer、MetaboAnalyst等，多元统计分析软件主要以Simca-P 为主[36]。

Qiao等[37]通过总结萜烯类成分质谱裂解规律，确定了特征离子过滤信息，在此基础上，结合多元统计学策略对姜黄中的萜烯类成分进行鉴定分析，最终从姜黄中辨识了846个萜烯类成分，其中包含2个潜在新化合物。Li等[38]通过HRMS结合多元统计分析鉴别策略对中成药滋肾丸进行大鼠血清药物化学研究，首先将HRMS得到的给药组和对照组的原始数据导入Progenesis QI 2.0中，进行标准化处理，然后采用OPLS-DA对血浆中外源性成分进行筛选，将VIP>1的组分的准确分子量以及碎片离子导入UNIFI 数据库进行匹配，最终辨识出22个原型成分和11个代谢产物，此方法的建立为进一步明确滋肾丸药效物质基础提供有力参考。Luo等[39]基于LC-MS技术，鉴定了栀子厚朴汤在大鼠血浆中的代谢产物。所有样品数据均经校准，并通过XCMS和MetAlign组合选择峰值，以收集三维数据集。通过多元统计分析将大鼠血浆中的外源性成分与内源性成分区分开来。金苗苗等[40]借助PCA鉴定给药大鼠粪便代谢物，成功识别出大鼠口服白桦脂酸后经生物转化的代谢物，从而建立了鉴定白桦脂酸体内代谢物的有效检测方法。娄港归[41]采用高分辨质谱PCL和OPLS-DA对玫瑰石斛和铁皮石斛的叶片和茎进行分析，研究石斛部位间和种间代谢产物的差异，得出两种石斛间主要差异成分为玫瑰石斛碱B、玫瑰石斛啶碱等。

HRMS结合多元统计分析对中药代谢物鉴别策略的优势在于能够快速排除生物样本内源性物质干扰，快速筛选出外源性成分，与代谢物数据匹配，进而实现对中药复杂体系体内代谢的快速辨识。

2.7 同位素标记鉴别策略

HRMS结合同位素标记鉴别策略一般适用于中药单体活性成分，通过对其进行同位素标记(如18 O、13 C等)后给药，通过同位素之间的特征性质量差进而对代谢产物进行追踪。Gao等[42]通过高分辨质谱结合Metabo-lynx软件对进行体外孵育代谢的姜黄素进行了18 O标记，从而对代谢产物进行追踪，共鉴定了3个代谢产物。Liu等[43]采用13 C对厚朴酚进行标记，对大鼠血浆、粪便和尿液中的代谢产物进行追踪，结果共获取67个代谢产物。汪戎锦[44]在研究刺五加叶治脑卒中尿液代谢组学时，用靶向官能团的试剂标记样本，使具相同官能团的代谢物产生衍生代谢物。采用液质联用结合同位素标记结合的方法,对体内羧酸类亚代谢组和胺类亚代谢组进行全面分析。此鉴别方法的弊端就是它仅适用于单体活性成分，对于成分繁多的中药，采用同位素标记鉴别代谢产物还比较困难。

2.8 多技术整合联用的代谢物鉴别策略

中药及其复方具有多成分、多靶点、多途径的特征，在防治疾病方面具有其明显的特色和优势，但同时由于中药进入体内的成分数量多，多靶点协同作用，使其有效成分鉴定过程变得复杂[45]。目前越来越多的学者采用高分辨质谱多种数据处理技术整合策略对中药体内成分进行辨识。

Mi等[46]采用多元统计分析和代谢物预测软件相结合的手段对中药复方丹栀片在大鼠体内的代谢产物进行鉴别，共鉴别了119个代谢物，两种代谢物鉴别策略联用极大地提高了代谢物鉴别的效率，而且相比单纯采用代谢物预测软件，还明显降低了代谢物遗漏的可能性。Wang等[47]将MDF技术、EIC技术以及同位素标记等代谢物鉴别策略进行整合，从中成药益心舒胶囊大鼠给药后的血浆、尿液和粪便中共鉴定了184种代谢物，其中包括62个代谢物。蔡芳[48]等采用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱质谱联用技术，将质量亏损过滤、中性丢失、诊断碎片离子过滤等技术互相融合，分析肾间质纤维化大鼠的血清大黄素代谢物，鉴定得出大鼠体内大黄素的11种代谢物。此方法有效地减少定性分析过程中干扰离子和基质的影响，提高代谢物定性分析的准确性和效率。田婷婷[49]在研究有抗癌作用的活性成分冬凌草甲素代谢物时，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术，融合提取离子、质量亏损过滤、子离子过滤、中性过滤四种数据处理策略进行数据处理，得到精准的代谢物分子质量，鉴定出大鼠口服冬凌草甲素之后的尿液代谢物。

对于中药复方体内代谢物表征，由于进入体内化学成分过多，且受内源性成分干扰，导致其鉴定过程十分困难，因此，利用高分辨质谱多种数据处理策略进行整合联用能够快速、高效、准确地对中药体内化学成分及其代谢产物进行鉴定。

3 结语

中药及其复方的有效组分和体内代谢产物的研究可为中药药效物质基础研究提供强有力支撑，推动中药现代化。但是由于中药成分复杂，且在体内代谢路径存在不可预知性，因此，如何在数量巨大的生物样本信息中辨识目标组分，是目前对中药体内代谢研究的重点和难点。本文归纳并梳理了近年来采用高分辨质谱多种数据处理策略对中药有效组分和体内代谢产物的鉴别方法。各种数据处理策略皆具有各自的利弊，如使用高分辨质谱结合代谢物预测软件虽可快速鉴别中药及其复方中的主要化学成分及其代谢产物，但因中药进入体内的代谢途径存在不可预测性，导致其代谢物鉴定存在遗漏。在未来的中药代谢产物鉴定工作中，可以建立一种符合中医药理论的多种数据处理策略整合联用的新技术，多种技术策略优势互补，从而提高鉴别效率和准确性，为阐明中医药理论的物质基础、实现中医药现代化提供新的技术手段。