不同土壤改良措施对连作半夏根际微环境的影响

刘诗蓉，王红兰，杨萍，孙辉，蒋舜媛，蒋桂华

(1.成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137；2.四川省中医药科学院，四川 成都 610041；3.四川大学 环境科学与工程系，四川 成都 610065)

大宗中药材半夏为天南星科植物半夏(Pinelliaternate(Thunb.) Breit.)的干燥块茎，始载于《神农本草经》[1]，具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结等功效[2]。四川内江和遂宁为川半夏传统的产区，据实地调查，半夏的连作障碍是制约其规模化发展的最主要因素。半夏连作障碍表现在植株生长不良和病虫害爆发严重，产量降低，寻找有效缓解半夏连作障碍的农艺措施或消减技术已成为其生产上亟待解决的热点问题之一[3]。

农业生产上主要采用农业生态防治(轮作和间套作、添加土壤改良措施改善土壤结构、pH和土壤微生态环境)，植物调控防治(抗病虫害品种的研发与应用)，生物防治(施用拮抗菌剂、微生物菌剂)和物理防治(土壤消毒、灌溉洗盐)等措施改善作物连作障碍[4]。

目前，半夏生产主要通过种茎消毒、土壤消毒和轮作等措施来缓解半夏连作障碍。这些处理方式可在一定程度上改善半夏根腐病的问题，但对土壤生态平衡影响小，且轮作周期长[5-8]。微生物区系的改变是半夏连作障碍形成的重要原因，目前有关半夏连作土壤改良方面的研究鲜有报道。本文通过对比2%生物炭、微生物菌剂、生物有机肥和草木灰等4种土壤改良措施，测定连作土壤微生物群落结构及半夏形态学及药材产量等指标，阐明不同土壤改良措施对半夏生长及根际微生态环境的影响，探索半夏连作障碍的最佳土壤改良措施，为缓解或消除半夏连作障碍提供理论指导和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

田间试验在四川天贝生态农业中药材试验基地内进行，基地座落于内江市，东经29°49′，北纬104°85′，海拔325 m左右，为亚热带湿润季风气候，冬暖夏热，雨量适中，年相对湿度约80%；年均降雨量约920 mm，该区域地形以低山丘陵为主。实验地土壤为紫红色砂质泥岩母质发育的中性至石灰性紫色土，为壤质土，其砂粒(粒径为0.05～2 mm)、粉粒(粒径为0.002～0.05 mm)及黏粒(粒径<0.002 mm)质量百分数分别为21%、51%和28%。本试验所用地块均为新开垦的土壤，实验开展前，持续在同一块地栽种半夏，形成连作2茬的处理样地并按生态种植模式进行实验栽培管理[9]。经测定，实验开展前连作2茬地土壤养分为全磷317.37 mg/kg，速效磷30.32 mg/kg、全氮97.97 mg/kg、速效氮13.99 mg/kg、速效钾75.83 mg/kg、有机质5.77 g/kg、全钾12.89 mg/kg。

1.2 试验材料及仪器

半夏种茎来自于重庆市大足县，直径为1.0～1.5 cm，经四川省中医药科学院周毅研究员鉴定为天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.) Breit．的新鲜块茎；2%生物炭(广东炭都生物科技控股有限公司)；微生物菌剂(济南源鹏化工有限公司)；生物有机肥(德强生物股份有限公司)；草木灰(四川天贝生态农业中药材试验基地)；DNA 提取试剂盒(PowerSoil® DNA Isolation kit)；SynergyHTX酶标仪(Gene Company Limited 基因有限公司)；Legend Micro 21高速离心机(EPPENDORF有限公司)；G560E振荡器(SI有限公司)。

1.3 大田实验设计

实验设头茬(CK1)、连作对照(CK2)、连作2茬地添加2%生物炭(A)、连作2茬地添加微生物菌剂(B)、连作2茬地添加生物有机肥(C)和连作2茬地添加草木灰(D)6个处理，具体操作方法如表1所示。小区布置采用随机区组设计，每一处理设置3次平行，小区与小区之间留30 cm间距，深度为10 cm，小区面积为3 m×1.2 m=3.6 m2。种茎在播种前用恶霉灵、春雷霉素和霜霉威盐按一定比例加水稀释成一定浓度，浸种30 min，晾干，并于播种前将同浓度药液喷淋于土壤表层深翻进行土壤消毒。半夏于2019-09-03播种，覆土深度为8 cm。整个试验过程田间管理措施均保持一致。

表1 缓解半夏连茬效应的土壤改良方法

1.4 样品采集

于半夏块茎膨大期(播种后60 d)按“S”布点法采集各小区半夏植株，测其生理指标。于成熟期(播种后90 d)测其药材产量，并收集半夏根际土壤，置于-80 ℃液氮罐中保存，用于根际土壤微生物群落高通量测序分析。

2 测定项目

2.1 半夏生理性状及产量

半夏叶长、叶宽、最长须根长和株高用直尺测定(精确到0.1 cm)；珠芽直径、茎粗、块茎直径用游标卡尺测定(精确到0.1 mm)；于每个小区拉出1 m2的样方，并将里面全部半夏块茎进行采挖，用电子天平测定鲜重(精确到 0.01 g)。

2.2 土壤微生物测序分析

取0.25 g土壤样品，按试剂盒(PowerSoil® DNA Isolation kit)操作流程，提取土壤总DNA，分别采用引物27F(5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′)/1492R(5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′)对细菌及真菌的rRNA基因的V1-V9区进行扩增，采用ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 对真菌的rRNA基因的V1-V9区进行扩增。通过Barcode区分样品序列，并对下机原始数据进行质量控制，去除特异性扩增序列及嵌合体。在相似性 97% 的水平上对序列进行聚类(USEARCH，version 10.0)，以测序所有序列数的 0.005%作为阈值过滤 OTU。使用Usearch软件对Tags在97%的相似度水平下进行聚类、获得OTU，并基于Silva(细菌)和UNITE(真菌)分类学数据库对OTU进行分类学注释。计算群落多样性Chao1指数、ACE指数和Shannon指数，并基于物种分类对门水平和属水平群落绘制条形图。

2.3 数据处理

采用Excel 2010、SPSS 20.00分析数据；采用Duncan’s法进行多重比较，以P<0.05为差异有统计学意义；采用Excel 2016绘制图形。

3 结果与分析

3.1 不同改良措施对半夏生理性状及产量的影响

不同改良措施对半夏生理性状的影响见表2所示，与头茬对照相比，半夏连作降低了叶片长、叶片宽、株芽直径、茎粗、株高、块茎直径、茎须根数和最长须根数等形态学指标。与连作对照相比，2%生物炭处理抑制了半夏叶片生长，且在田间其叶片呈浅黄色；生物有机肥和草木灰处理可促进半夏根系的发育。微生物菌剂不仅促进半夏叶长的伸长，珠芽的生长，还可促进块茎的发育以及根系的生长。不同土壤改良措施对半夏产量的影响如图1所示。头茬处理(CK1)下半夏产量最高，为0.456 kg/m2。连作后不同土壤改良措施下半夏产量均显著下降，最高下降82.73%。与连作对照(CK2)相比，生物有机肥和草木灰处理下半夏产量分别增加3.11%和15.35%，而2%生物炭和微生物菌剂处理则分别下降44.86%和5.66%。结合半夏块茎膨大期形态学数据分析，2%生物炭处理在该时期显著抑制半夏生长，这可能是导致产量显著降低的重要原因。

表2 不同土壤改良措施下半夏茎膨大期生理特征

图1 不同土壤改良措施对半夏产量的影响

3.2 不同改良措施对根际土壤微生物多样性的影响

Chao1指数和ACE指数是一种衡量物种丰度的指数，即表示物种数量的多少，Chao1指数和ACE指数值越大，即表示物种丰度越大。Shannon指数则能反映样品中微生物的多样性，Shannon指数越大则种类越多，物种越丰富。不同处理下半夏根际土壤细菌和真菌的多样性参数值见表3。对于土壤中的细菌，微生物菌剂、生物有机肥和草木灰处理下其ACE指数均高于连作对照，说明这3种改良措施可提高半夏连作土壤中细菌的物种丰度。微生物菌剂和生物有机肥处理下细菌Shannon指数值高于连作对照，说明微生物菌剂和生物有机肥可增加连作土壤中细菌多样性。对于土壤中的真菌，微生物菌剂、生物有机肥和草木灰处理下其Chao1和ACE指数均高于连作对照，说明微生物菌剂、生物有机肥和草木灰处均可降低真菌的物种丰度。2%生物炭、生物有机肥和草木灰均降低了连作土壤中真菌的Shannon值，表明其降低了连作土壤中真菌多样性。

表3 不同土壤改良措施对半夏根际土壤微生物多样性的影响

3.3 不同改良措施对根际土壤微生物群落结构的影响

不同改良措施对根际土壤细菌在门水平的影响见图2所示，土壤中优势的细菌群落包括Proteobacteria(变形菌门)、Planctomycetes(浮霉菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)和Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)。与连作对照相比，生物有机肥和草木灰均增加了土壤中变形菌门细菌的丰度，而2%生物炭和微生物菌剂均减少了变形菌门细菌的丰度。与头茬对照相比，连作对照增加了酸杆菌门细菌丰度，而生物有机肥和草木灰均可降低酸杆菌门细菌在连作土壤中的丰度。连作降低了拟杆菌门细菌在半夏根际土壤中的丰度，而2%生物炭、微生物菌剂、生物有机肥和草木灰均增加了拟杆菌门细菌在连作土壤中的丰度，且增加程度草木灰>微生物菌剂>生物有机肥>2%生物炭。连作增加了芽单胞菌门细菌在半夏根际土壤中的丰度，而2%生物炭、微生物菌剂、生物有机肥和草木灰均减少其在连作土壤中的丰度，且减少程度草木灰>微生物菌剂>生物有机肥>2%生物炭。

图2 不同土壤改良处理下半夏根际土壤细菌门水平群落组成

不同改良措施对根际土壤真菌在门水平的影响见图3所示，土壤中优势的真菌群落包括Ascomycota(子囊菌门)、Basidiomycota(担子菌门)、Chytridiomycota(壶菌门)、Mortierellomycota(丝孢菌门)和Mucoromycota(毛霉门)。连作增加了子囊菌门真菌的丰度，2%生物炭、微生物菌剂、生物有机肥和草木灰均可降低其在连作土壤中的丰度，其减少幅度为2%生物炭>微生物菌剂>生物有机肥>草木灰。连作降低了担子菌门真菌的丰度，微生物菌剂、生物有机肥和草木灰均可增加担子菌门真菌在连作土壤中的丰度，其在土壤中的丰度生物有机肥>微生物菌剂>草木灰。同时，连作还降低了壶菌门真菌的丰度，2%生物炭、微生物菌剂和生物有机肥均可增加其在连作土壤中的丰度，且在各处理中的丰度2%生物炭>微生物菌剂>生物有机肥。对于丝孢菌门真菌，连作增加其丰度，而2%生物炭、生物有机肥和草木灰则降低其丰度，降低幅度顺序为生物有机肥>草木灰>2%生物炭。对于毛霉门真菌，连作增加了毛霉门真菌的其丰度，2%生物炭、微生物菌剂、生物有机肥和草木灰则均降低其丰度，降低幅度2%生物炭>生物有机肥>草木灰>微生物菌剂。

图3 不同土壤改良处理下半夏根际土壤真菌门水平群落组成

不同改良措施对根际土壤细菌在种水平的影响见图4所示，2%生物炭、微生物菌剂、生物有机肥和草木灰处理均可以降低(果胶杆菌)的丰度，其在土壤中的丰度大小顺序为微生物菌剂<2%生物炭<草木灰<生物有机肥<头茬对照<连作对照。对于Acinetobacterrudis(鲁迪斯不动杆菌)，其在草木灰处理中丰度最大达到23.36%，其他处理几乎为零。

图4 不同土壤改良处理下半夏根际土壤细菌种水平群落组成

不同改良措施对根际土壤真菌在种水平的影响见图5所示，连作增加了Arthrobotrys oligospora(少孢节丛孢菌)的丰度。不同处理下Arthrobotrys oligospora(少孢节丛孢菌)丰度的顺序为草木灰>连作对照>微生物菌剂>2%生物炭>生物有机肥>头茬对照。对于Mortierellaalpina(高山被孢霉)，连作增加其丰度，而2%生物炭、微生物菌剂、生物有机肥和草木灰处理则降低其在连作土壤中的丰度，不同处理下其丰度大小顺序为连作对照>微生物菌剂>2%生物炭>草木灰>生物有机肥>头茬对照。

图5 不同土壤改良处理下半夏根际土壤真菌种水平群落组成

4 讨论

土壤微生物结构稳定性和功能多样性对维持土壤系统健康有非常重要的作用，而土壤微生物结构和活性的稳定性取决于微生物多样性[10]。随连作年限的增加，土壤微生物群落多样性降低，群落结构简单化[11]。已有研究证实，土壤养分的吸收和转化受微生物影响[12]，而微生物种群组成失衡会降低土壤质量和作物产量[13]。王觉等[14]研究表明半夏连作后，真菌成为土壤优势种群，即土壤有由细菌型土壤向真菌型土壤转变的趋势，一般认为真菌型土壤是地力衰竭的标志。实验发现微生物菌剂、生物有机肥和草木灰均可显著提升半夏连作土壤中细菌的物种丰度。微生物菌剂和生物有机肥均可增加连作土壤中细菌多样性。微生物菌剂、生物有机肥和草木灰处均可降低真菌的物种丰度。2%生物炭、生物有机肥和草木灰均可降低连作土壤中真菌多样性。不同土壤修复措施通过降低真菌物种多样性提高细菌多样性起到恢复连作土壤微生物群落多样性的作用。

酸杆菌门多存在于营养贫瘠的土壤环境中，其丰富度与土壤质量呈负相关[15]。实验发现连作增加了酸杆菌门细菌丰度，而生物有机肥和草木灰均可通过降低酸杆菌门细菌在连作土壤中的丰度进而改善土壤质量。高水平的子囊菌门菌群与病害发生有着密切的关系[16]，实验发现2%生物炭、微生物菌剂、生物有机肥和草木灰均可降低其在连作土壤中的丰度，其减少幅度2%生物炭>微生物菌剂>生物有机肥>草木灰。Pectobacteriumaroidearum(果胶杆菌)是一种致病菌，2%生物炭、微生物菌剂、生物有机肥和草木灰处理均可以降低Pectobacteriumaroidearum(果胶杆菌)的丰度，且微生物菌剂修复效果优于其他修复措施。

单从产量分析草木灰和微生物有机肥均对连作半夏生长及根际微环境产生有益影响，且以草木灰为优，微生物有机肥次之。其他改良措施对半夏连作土壤养分及微生物群落结构亦产生有益影响，但对半夏生长发育产生抑制效应，后期可考虑调节使用量和配方施肥进一步改善连茬效应。