内生解淀粉芽孢杆菌L-4-3 发酵条件的优化

解丽娟，肖 蕾，伍善东，程 伟

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是广泛存在于自然界的一种非致病细菌。据文献报道，该菌抗菌谱广，对镰刀菌（Fusariumspp.）、桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）、灰霉病菌（Botrytis cinereaPers.）、棉花黄萎病菌（Verticillium dahliaeKleb）、番茄叶霉病菌（Fulvia fulva）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici）均有较强的抑制作用[1-4]，还可以分泌一些植物激素类物质，促进植物生长[5]。以该菌为资源进行生物防治具有对环境友好、对人畜毒害小、对植物副作用小等优点，越来越受到人们的重视。

课题组前期从油菜植株内分离到一株内生解淀粉芽孢杆菌L-4-3（菌株保藏号为CCTCC NO：M2014320）。杯碟法对峙试验和盆栽试验中均证明该菌株对油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）有很强的拮抗作用，同时还具有溶磷解钾的能力。因此，笔者认为该菌株有望开发成植物病害生防制剂，用于油菜菌核病的生物防治。为了进一步提高L-4-3 菌株的发酵水平，通过单因素试验和正交试验优化了该菌株的培养基成分和培养条件，以期为该生防菌株的产业化利用提供支撑。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与培养基

供试菌为内生解淀粉芽孢杆菌L-4-3，菌株保藏号为CCTCC NO：M2014320，由笔者所在课题组筛选。基础培养基：淀粉20.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏4.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 值7.0。

1.2 试剂与仪器

试验所用生化试剂均为国产分析纯，淀粉、黄豆粉等原料购自超市。20 L、50 L 全自动发酵罐（BIOTECH-20JS、BIOTECH-50JS）购自上海保兴生物设备工程有限公司。

1.3 解淀粉芽孢杆菌L-4-3 培养基成分的筛选

1.3.1 种子液的制备将活化后的L-4-3 菌株接种于装有50 mL LB 液体培养基的500 mL 三角瓶中，在30℃、180 r/min 的条件下振荡培养20 h。

1.3.2 培养基成分的筛选通过单因素试验筛选适合菌株的最佳碳源、氮源、无机盐，再用正交试验法确定碳源、氮源的最佳添加量[6]。（1）碳源的筛选。分别以含量为20 g/L 的淀粉、乳糖、葡萄糖、甘露醇和蔗糖替换基础培养基中的碳源，500 mL 三角瓶中装液量为100 mL，每个摇瓶中接入5 mL 种子液，于30℃、180 r/min 条件下振荡培养48 h；采用平皿菌落计数法测定发酵液中的活菌数，以菌液浓度为考察指标确定最优处理。（2）氮源的筛选。分别以含量为20 g/L 的黄豆粉、酵母粉、鱼粉、蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸铵替换基础培养基中的氮源，其他条件和考察方法同上。（3）碳源、氮源的最适添加量确定。以最优碳源、氮源进行正交试验，确定各组分的最佳添加量，其他条件和考察方法同上。（4）无机盐的筛选。分别添加1 g/L 的KH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl、NaCl、钾长石替换基础培养基中的无机盐，其他条件和考察方法同上。（5）无机盐的最适添加量。在基础培养基中分别添加1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L的KH2PO4和NaCl 以 及0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L 的MgSO4·7H2O，其他条件和考察方法同上。

1.4 解淀粉芽孢杆菌L-4-3 培养条件的优化

以优化后的培养基进行培养条件的优化。培养温度设置为20、24、28、32、36℃[7]，培养时间设置为44、48、52、56、60、64、68、72 h，初 始pH 值 设置为6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4，转速设置为90、120、150、180、210 r/min，接种量设置为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%，500 mL 三角瓶装液量设置为40、60、80、100、120、140 mL，其他条件和考察方法同上。

1.5 50 L 发酵罐验证试验

采用优化后的培养基成分和培养条件进行50 L发酵罐试验，采用平皿菌落计数法测定发酵液中的活菌数量，以菌液浓度为最终衡量指标。

1.6 数据处理

试验数据重复3 次取平均值，采用Excel 2007 软件和SPSS 25 软件进行数据整理、统计与分析。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌L-4-3 培养基成分的筛选

2.1.1 最佳碳源、氮源的筛选从图1 可知，当以甘露醇为碳源时，菌液浓度达到最大值，为9.3×108CFU/mL；以乳糖为碳源时，发酵液中的活菌数最少，为2.9×108CFU/mL，以淀粉为碳源时，菌液浓度为5.1×108CFU/mL。由图2 可知，以酵母粉为唯一氮源时，菌液浓度达到最大值，为9.7×108CFU/mL，其余氮源处理的菌液浓度由高到低排列依次为胰蛋白胨＞蛋白胨＞黄豆粉＞鱼粉＞硫酸铵。综合考虑成本因素，甘露醇和淀粉、酵母粉和黄豆粉可分别作为最佳碳源、氮源进行下一步试验。

图1 不同碳源处理发酵液中的菌液浓度

2.1.2 碳源、氮源最适添加量的确定根据单因素试验结果，适宜碳源为甘露醇和淀粉，适宜氮源为酵母粉和黄豆粉。为了确定各组分的最佳添加量，以这4种物质为因素、以其添加量为水平设计L9(34)正交试验，详见表1。通过均值和极差分析发现，各因素对L-4-3 菌株发酵液活菌数的影响由大到小排列依次为甘露醇＞酵母粉＞淀粉＞黄豆粉。培养基碳源、氮源成分及含量的最优组合为A1B2C3D3，即黄豆粉1.0 g/L、淀粉20.0 g/L、酵母粉2.0 g/L、甘露醇10.0 g/L。

表1 正交试验设计及结果

2.1.3 无机盐的筛选由图3 可知，添加KH2PO4、NaCl、MgSO4·7H2O 的处理菌液浓度基本相当，其中添加MgSO4·7H2O 的处理，菌液浓度最高，为6.6×108CFU/mL。后续试验中选择KH2PO4、NaCl 和MgSO4·7H2O 作为培养基的无机盐成分。

图3 添加不同无机盐发酵液的菌液浓度

2.1.4 无机盐最适添加量的确定由图4 可知，随着KH2PO4添加量的增加，菌液浓度呈先升高后降低的趋势，当添加量为4.0 g/L 时，菌液浓度达最大值为5.9×108CFU/mL。由图5 可知，随着NaCl 添加量的增加，菌液浓度也随之增加，当添加量为4.0 g/L 时，菌液浓度达最大值，为9.1×108CFU/mL，当添加量为5.0 g/L 时，菌液浓度反而降低。由图6 可知，随着MgSO4·7H2O 添加量的增加，菌液浓度呈先升高后降低的趋势，当添加量为3.0 g/L 时，菌液浓度达最大值，为10.8×108CFU/mL。因此，最终确定培养基中无机盐的最适添加量为KH2PO44.0 g/L、NaCl 4.0 g/L、MgSO4·7H2O 3.0 g/L。

图4 添加不同量的KH2PO4 对菌液浓度的影响

图5 添加不同量的NaCl 对菌液浓度的影响

图6 添加不同量的MgSO4·7H2O 对菌液浓度的影响

2.2 解淀粉芽孢杆菌L-4-3 培养条件的优化

2.2.1 初始pH值 由图7 可知，当培养基的初始pH值为6.0～7.2 时，发酵结束菌液浓度的变化不明显；当初始pH 值为8.4 时，其菌液浓度最低，为3.4×108CFU/mL；初始pH 值为7.2 时，其菌液浓度最高，为7.1×108CFU/mL。因此，确定菌株L-4-3 的最适初始pH 值为7.2。

图7 初始pH 值对发酵液的菌液浓度的影响

2.2.2 装液量由图8 可知，当500 mL 的三角瓶装液量为40 mL 时，发酵结束时菌液浓度最高，为19.4×108CFU/mL，随着装液量的增加，菌液浓度逐渐降低。因此，确定菌株L-4-3 发酵培养的最佳装液量为40 mL/500 mL 三角瓶，即装液量8%。

图8 装液量对发酵液的菌液浓度的影响

2.2.3 接种量由图9 可知，当接种量为2.0 %时，菌液浓度达最大值，为12.8×108CFU/mL；继续增加接种量，菌液浓度反而降低。因此，确定菌株L-4-3发酵培养的最适接种量为2.0 %。

图9 接种量对发酵液的菌液浓度的影响

2.2.4 培养温度由图10 可知，随着培养温度的升高，菌株L-4-3 发酵结束时菌液浓度逐渐增加，当培养温度为32℃时，菌液浓度达到最大值，为20.1×108CFU/mL，随后，培养温度继续升高，菌液浓度逐渐变小。因此，确定菌株L-4-3 的最适培养温度为32℃。

图10 培养温度对发酵液的菌液浓度的影响

2.2.5 转速 由图11 可知，随着转速的增加，菌液浓度先升高后降低；当转速为180 r/min 时，菌液浓度达最大值，为10.1×108CFU/mL。因此，确定菌株L-4-3 的最适转速为180 r/min。

图11 转速对发酵液的菌液浓度的影响

2.2.6 培养时间由图12 可知，随着培养时间的延长，发酵结束时菌液浓度呈现先升高后降低的趋势；当培养时间为68 h 时，其菌液浓度为最高，达到17.0×108CFU/mL；继续增加培养时间，菌液浓度有所降低。因此，确定菌株L-4-3 的最适培养时间为68 h。

图12 培养时间对发酵液的菌液浓度的影响

综合上述试验结果，菌株L-4-3 发酵培养的最佳条件为初始pH 值7.2，装液量8%，接种量2.0 %，温度32℃，转速180 r/min，培养时间68 h。

2.3 L-4-3 菌株50 L 发酵罐验证试验结果

采用最适培养基配方即甘露醇10.0 g/L、淀粉20.0 g/L、酵母粉2.0 g/L、黄豆粉1.0 g/L、KH2PO44.0 g/L、NaCl 4.0 g/L、MgSO4·7H2O 3.0 g/L，最适培养条件即初始pH 值7.2、装液量8%、接种量2.0 %、温度32℃、转速180 r/min、培养时间68 h，发酵结束采用平皿菌落计数法测定发酵液中的活菌数为20.8×108CFU/mL。

3 讨论与结论

近年来，微生物菌剂成为植保领域的研究热点，关于解淀粉芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件优化的研究报道较多[8-10]。在生产应用中，有效活菌数是影响微生物菌剂的关键因素。因此，优化菌株的发酵培养基配方和培养条件，提高发酵液中的活菌数是研发生防微生物菌剂的关键所在[2]。

该研究从培养基成分和培养条件2 个方面对内生解淀粉芽孢杆菌L-4-3 的发酵水平进行了研究，碳源、氮源对L-4-3 菌株菌液浓度的影响依次为甘露醇＞酵母粉＞淀粉＞黄豆粉，碳源、氮源最优配比为甘露醇10.0 g/L、淀粉20.0 g/L、酵母粉2.0 g/L、黄豆粉1.0 g/L，无机盐最适添加量为KH2PO44.0 g/L、NaCl 4.0 g/L、MgSO4·7H2O 3.0 g/L。摇瓶发酵最适培养条件为初始pH 值7.2、装液量8%（500 mL 三角瓶装液40 mL）、接种量2.0 %、温度32℃、转速180 r/min、培养时间68 h。以优化后的培养基和培养条件进行50 L 发酵罐验证，发酵液中活菌数为20.8×108CFU/mL。