食品中单核细胞增生李斯特氏菌测定能力验证分析

杨 滴

（大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁大连 116600）

单核细胞增生李斯特氏菌属李斯特氏菌属，是人类常见的食源性致病菌，该菌广泛存在于自然界，很容易污染食品。其中，肉制品、奶与奶制品、水产品、蔬菜等更容易受单核细胞增生李斯特氏菌污染[1]。单核细胞增生李斯特氏菌具有较强的致病性、抗逆袭性，即使在较低的冷藏温度下仍可以繁殖，极易感染孕妇、婴儿、老年人及免疫力低下者，感染后可引起败血症、肠胃炎、脑膜炎、孕妇流产等[2-6]。食品安全国家标准对其限量进行了严格的规定[7]，同时食品检验机构的单核细胞增生李斯特菌的检出能力也是评价其技术能力的重要指标。

能力验证是评价实验室检测能力的重要手段，参加能力验证活动既可加强各实验室间的技术交流，又可提高其检测能力和水平[8-9]。为验证本实验室食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测能力保持情况，参加中国食品药品检定研究院组织的食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证，同时使用常规培养法、全自动酶联免疫荧光分析仪法和实时荧光PCR法3种方法对样品进行检测分析，现将本次能力验证的过程、结果以及其中采用的操作进行总结分析，以期能够更好地指导今后的检验工作。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

中国食品药品检定研究院组织实施食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证，组织方提供两个待测样品，编号分别为CODE034和CODE164，每个样品由真空包装于西林瓶的白色菌球和25 g奶粉组成。

李氏增菌肉汤（LB1、LB2）、PALCAM琼脂、李斯特氏菌显色培养基、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）、木糖发酵管和鼠李糖发酵管等相关配套试剂为北京陆桥技术股份有限公司产品；VIDAS单核细胞增生李斯特氏菌酶联免疫试剂盒、VITEK 2 COMPACT革兰氏阳性细菌鉴定卡、Half-FRASER肉汤和FRASER肉汤为法国生物梅里埃公司产品；单核细胞增生李斯特氏菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）和细菌基因组DNA快速提取试剂盒为广州双螺旋基因技术有限公司产品。

1.2 主要仪器

LRH-250型生化培养箱；VITEK 2 COMPACT全自动微生物鉴定仪；VIDAS 30全自动荧光免疫分析仪；QS7 Flex实时荧光定量PCR仪。

1.3 实验方法

1.3.1 常规培养法

根据食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证参试指导书要求，开启西林瓶，将白色菌球和25 g奶粉加入到225 mL李氏增菌肉汤LB1中。增菌、分离、鉴定步骤依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）第一法[10]。LB1肉汤于30 ℃培养24 h后，取0.1 mL LB1增菌液转种于10 mL LB2肉汤中，于30 ℃培养24 h。取LB2增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和PALCAM琼脂平板上，36 ℃培养18 h。典型单核细胞增生李斯特氏菌菌落在李斯特氏菌显色平板上的典型菌落特征为蓝绿色菌落、周围有白色晕圈；在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈；在PALCAM琼脂平板和李斯特氏菌显色平板上分别挑取5个典型菌落，将其分别接种于木糖、鼠李糖发酵管，于36 ℃培养24 h，同时在TSA-YE平板上划线，于36 ℃培养24 h，然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。疑似菌株采用VITEK 2 COMPACT全自动微生物鉴定仪进行鉴定。

1.3.2 全自动酶联免疫荧光分析仪法

按照《食品中沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157及单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验 酶联免疫法》（GB/T 22429—2008）[11]规定的步骤及试剂盒说明进行实验，取1.3.1中LB1增菌液25 mL，加入225 mL Half-FRASER肉汤增菌液中，30 ℃培养24 h，移取1 mL增菌液转种于10 mL FRASER肉汤中，30 ℃培养24 h。取1 mL FRASER肉汤中增菌液到灭菌小试管中，于沸水中加热15 min，取0.5 mL热处理后的增菌液加入到酶联免疫试剂盒的测试孔中，进行酶联免疫反应后，通过VIDAS 30全自动荧光免疫分析仪检测样本反应值，同时与阳性标准品反应值比较，判定检测结果。

1.3.3 实时荧光PCR检测法

取1.3.1中LB1增菌液1 mL于1.5 mL离心管中，12 000 r·min-1离心5 min，弃上清；向沉淀中加入100 μL细菌基因组DNA快速提取试剂盒中的裂解液，漩涡振荡10 s，沸水浴5 min，12 000 r·min-1离心5 min，吸取上清，获得样品DNA。

按照单核细胞增生李斯特氏菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）中说明书要求，取试剂盒中A-LM-P预混液20 μL，加入5 μL DNA模板，构建25 μL实时荧光PCR反应体系。实时荧光PCR反应程序为95 ℃预变性3 min，然后进入循环反应，即94 ℃变性5 s、60 ℃退火和延伸40 s，共40个循环。荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。实时荧光PCR反应同时设置阳性对照和阴性对照，收集荧光信号，根据样品PCR反应的Ct值及扩增曲线分析实验结果。

2 结果与分析

2.1 常规培养法检测结果

CODE034、CODE164两个样品在LB1和LB2增菌液中培养后，培养物呈浑浊状态，表明样品中的微生物在培养基中有生长。LB2增菌液划线分离后，CODE034样品在PALCAM琼脂平板和李斯特氏菌显色平板上均有典型菌落；CODE164样品在李斯特氏菌显色平板上无典型菌落。挑取2个样品的典型菌落接种于木糖发酵管、鼠李糖发酵管进行培养。结果显示，CODE034、CODE164两个样品的木糖阴性、鼠李糖阳性。在溶血实验中，CODE034有溶血圈、CODE164无溶血圈；典型菌落在TSA-YE平板纯化后，在VITEK 2 COMPACT全自动微生物鉴定系统进行鉴定，实验结果见表1和表2。

表1 生化反应实验结果

表2 全自动微生物鉴定系统鉴定结果

2.2 全自动酶联免疫荧光分析仪法检测结果

依据试剂盒判定原则，阳性参照值为0.05，若检测结果值≥0.05，结论判定为阳性，检测结果值＜0.05，结论判定为阴性。由表3可知，CODE034样品单核细胞增生李斯特氏菌检测阳性，CODE164样品单核细胞增生李斯特氏菌检测阴性。

表3 单核细胞增生李斯特氏菌VIDAS检测结果

2.3 实时荧光PCR法检测结果

以单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株为阳性对照、金黄色葡萄球菌标准菌株为阴性对照，同CODE034、CODE164两个样品进行实时荧光PCR反应。依据试剂盒判定原则，即样品检测Ct值≤35，判定单核细胞增生李斯特菌阳性；35＜样品检测Ct值＜40，建议样本重做，重做结果样品检测Ct值≥40，判定单核细胞增生李斯特菌阴性，否则判定为单核细胞增生李斯特菌阳性；样品检测Ct值≥40，判定单核细胞增生李斯特菌阴性。由图1可知，CODE034、CODE164、阳性对照、阴性对照的实时荧 光PCR反应Ct值分 别 为21.45、undetermined、17.66、undetermined。实验结果表明，CODE034样品中检出单核细胞增生李斯特氏菌，CODE164未检出单核细胞增生李斯特氏菌

图1 CODE034、CODE164实时荧光PCR检测法检测结果图

3 结论与讨论

单核细胞增生李斯特氏菌常规培养法是微生物检验中传统生化鉴定方法，其鉴定准确率较高，一般的实验室都能开展。但对操作人员的操作能力和培养基质量性能等要求较高，溶血实验难度较大，对于经验不足的检验员易产生假阳性和漏检；检测时间较长，至少需要6 d才能获得实验结果。VITEK 2 COMPACT自动微生物鉴定系统常用于微生物检测的生化鉴定，是一种可靠的、快速的生化鉴定方法，相较于常规的培养基生化鉴定能够基本排除人的能力因素[13]。本次能力验证CODE034样品分离得到疑似菌落鉴定为单核细胞增生李斯特氏菌，CODE164样品分离得到疑似菌落英诺克李斯特氏菌，VITEK 2 COMPACT给出的鉴定概率均为99%，与后期收到的能力验证结果一致。

全自动酶联免疫荧光分析仪法的检测时间为2 d，优势较为常规培养法明显，检测结果亦准确，但设备、试剂都必须为生物梅里埃公司的产品，价格较贵。同时，构建VIDAS法检测单核细胞增生李斯特氏菌的标准曲线有效期为14 d，需要经常性定标。

实时荧光PCR检测法的最快检测时间为1 d，相对常规培养法方便快捷、灵敏度高、准确性好，目前已应用到很多的细菌鉴定中，是常规培养法辅助检测的首选。其缺点为容易被能力验证组织者人为添加的死菌干扰，出现假阳性的结果。

本次参加食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测能力验证，后期收到了“满意”证书，有效地验证了实验室的单核细胞增生李斯特氏菌检测能力，提升了实验室的检验能力和质量控制水平。本次能力验证以常规培养法为基础，将免疫学、分子生物学等简便快捷辅助方法相结合，确保结果的准确性和快速性。开拓致病菌检测新思路，为今后微生物检测的发展提供了方向。