不同产品中红曲霉代谢产物的差异性研究

岳倩倩，王先桂，田 多

（茅台学院，贵州仁怀 564507）

红曲霉是一种丝状腐生真菌，在分类学地位上，其隶属于真菌门子囊菌亚门不整囊菌纲散囊菌目红曲菌科[1]。因在生产过程中能产生色素、淀粉酶等代谢产物，现已被广泛研究。由于红曲霉的代谢产物红曲色素具有安全性和稳定性，人们将其应用于肉制品、豆腐乳制品或酿酒行业[2-5]。同时，红曲霉在生产过程中产生的糖化酶、酯化酶、蛋白酶等酶类，在相互作用下，可生成核苷酸、氨基酸、单糖等呈味物质和酯类、醇类等香气物质，对发酵食品的风味起着重要作用[6]。在医药方面，有研究表明，红曲霉生长过程中产生的次级代谢产物洛伐他汀具有降低血脂和降胆固醇的作用；γ-氨基丁酸具有降血压、助睡眠、抗惊厥等作用[7]。

现阶段，人们将大米作为红曲霉的发酵基质，最终以红曲米的形式在市面上进行销售。有研究表明，在用大米作为红曲霉发酵基质时，以粳米为基质发酵更利于产生黄色素和红色素[8]。但是，现存于市面上的红曲米产品众多，人们如何在众多的产品中挑选合适的产品就显得尤为困难。因此，本文从网上随机挑选3款红曲产品，利用微生物实验方法和试剂盒法，对3款红曲产品中红曲霉所产色素含量、淀粉酶活性进行研究，以期通过上述实验的开展，选出优质的红曲产品，为人们在挑选和购买红曲产品时提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

从淘宝网上随机挑选3款红曲产品，品牌为某本红曲米、某杰红曲米和某田红曲米，通过分离纯化，得到3株红曲霉菌株，命名为MN-1、MN-2和MN-3。

1.2 试剂及培养基

麦芽糖，山东绿英化工科技有限公司；蛋白胨，青岛青药生物工程有限公司；酵母膏，国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖，重庆万盛川东化工有限公司；无水乙醇，天津市科密欧化学试剂有限公司；淀粉酶试剂盒，索莱宝生物有限公司；沙氏培养基（酵母膏 5 g·L-1，蛋白胨 10 g·L-1，麦芽糖 5 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，琼脂 20 g·L-1，121 ℃灭菌 25 min）。

1.3 仪器与设备

LDZX-50KBS立式高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1F超净工作台，苏州净化设备有限公司；振荡培养箱，广东省医疗器械厂；医用离心机，曦瑪离心机（扬州）有限公司；752-Pro紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；XS-212-202双目生物显微镜，南京江南永新光学有限公司；HH-8恒温水浴锅，常州金坛良友仪器有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 菌种活化

将3种红曲米分别放入研钵进行粉碎处理，然后称取红曲粉10 g于250 mL三角瓶中，加入100 mL无菌水，放入恒温振荡培养箱中，28 ℃、80 r·min-1的条件下恒温振荡培养24 h使红曲霉菌种活化。

1.4.2 菌种分离

用稀释涂布法将已活化的红曲霉菌液接种到灭菌的沙氏培养基上，放置30 ℃的恒温培养箱中10 d后取出，挑选红曲霉单菌落菌株，然后转接到沙氏斜面培养基上进行培养，用于后续实验。

1.4.3 形态观察

将保存在斜面培养基上的红曲霉菌株分别点种在沙氏平板培养基上，然后放置到28 ℃恒温培养箱中培养10 d后取出,观察菌落形态、隆起度及变色时间，并用直尺测量菌落直径。

1.4.4 孢子悬液制备

将已活化的红曲霉菌株用无菌水洗下后，经4层滤纸过滤到无菌三角瓶中，然后将滤液分装于10 mL无菌离心管中进行3次离心，条件为4 000 r·min-1，10 min，然后分别接种到30 mL的液体培养基中，每样本3个平行，孢子液终浓度大约为4×105CFU·mL-1，置于摇床上振荡培养7 d，培养条件为 30 ℃，230 r·min-1。

1.4.5 色素测定方法

取适量菌液和菌丝，研磨混匀后，取0.25 mL于10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至10 mL，颠倒混匀后置于恒温水浴锅中浸提30 min。浸提结束后，取出冷却至室温。经过滤后，用70%乙醇稀释滤液至适当倍数，以70%乙醇为对照，在505 nm下测定吸光度值，根据吸光度值计算色价。色价计算公式为色价=吸光度值×稀释倍数。

1.4.6 淀粉酶活性检测

根据淀粉酶试剂盒说明书分别处理说明书中的试剂一、试剂二和制备10 mg·mL-1葡萄糖标准液，然后将葡萄糖标准液用蒸馏水稀释为1.000 00 mg·mL-1、 0.200 00 mg·mL-1、0.100 00 mg·mL-1、0.050 00 mg·mL-1、0.025 00 mg·mL-1、0.012 50 mg·mL-1和0.006 25 mg·mL-1的标准溶液，制作标准曲线。取两支EP管分别加入250 µL淀粉酶原液和淀粉酶稀释液，沸水浴5 min，分别作α-淀粉酶和β-淀粉酶对照管，并依次加入MN-1、MN-2、MN-3这3种菌液，于540 nm处测定吸光度值。

α-淀粉酶活性计算公式为

式中：x1为α-淀粉酶浓度，mg·mL-1；x2为总淀粉酶浓度，mg·mL-1；W为样品重量，g。

2 结果与分析

2.1 不同产品中红曲霉菌落形态差异性比较

由图1可知，在3种红曲霉菌株中，MN-1菌落形态为棉絮状，气生菌丝发达，呈放射状，在培养至第8 d时，平板中产生大量色素，且中间凸起有褶皱，边缘整齐，菌落直径可达69 nm；MN-2菌落形态为棉絮状，气生菌丝较为发达，呈放射状，在培养至第8 d时，平板中产生大量色素，中间凸起，边缘整齐，菌落直径可达57 mm；MN-3菌落形态为棉絮状，气生菌丝较为发达，呈放射状，在培养至第8 d时，平板中产生色素，中间凸起，边缘整齐，菌落直径可达49 mm；因此，在相同的培养时间下，菌株MN-1生长较好。

图1 不同产品中红曲霉菌落形态

2.2 不同产品中红曲霉色素含量的测定

对于红曲霉色素的产生，现已有研究表明，红曲霉产生的色素有非水溶性和水溶性两种。非水溶性色素为胞内累计，存在于菌丝内，需用有机溶剂进行提取；水溶性色素为胞外蓄积，存在于发酵液中。当色素吸收波长在410 nm时定义为黄色素，在470 nm时定义为橘色素，在510 nm时定义为红色素。根据1.4.5方法，测定3种品牌中红曲霉产色素含量的差异。由表1可知，在所测胞外色素含量中，MN-2菌株生成的色素含量最高，色价为9.61 U·mL-1；其次为MN-1菌株，生成的色素色价为8.53 U·mL-1；菌株MN-3生成的色素量最低，色价为6.44 U·mL-1。在所测胞内色素含量中，MN-2菌株生成的色素含量最高，色价为8.71 U·mL-1;其次为MN-1菌株，生成的色素色价为8.42 U·mL-1；色素生成量最低的为菌株MN-3，色价为6.12 U·mL-1。经过整体分析可知，色素含量最高的菌株为MN-2，其色价为18.32 U·mL-1。

表1 不同产品中红曲霉吸光度值和色价的测定

2.3 淀粉酶溶液标准曲线的绘制

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，是目前发酵工业上应用最广泛的一类酶。通过采用1.4.6方法，制作淀粉酶标准曲线，结果如表2所示。

根据表2结果，以淀粉酶标准溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制溶液标准曲线。结果表明，淀粉酶标准品回归方程为Y=0.347 7X+0.034 1，相关系数r=0.999 4。因此，淀粉酶标准溶液在0.006 25～1.000 00 mg·mL-1线性关系良好，可用于后续淀粉酶浓度的计算。

表2 淀粉酶标准样品的吸光度值

2.4 不同产品中红曲霉淀粉酶活性含量的测定

红曲霉在生长过程中可代谢产生淀粉酶、糖化酶等酶活力，通过采用1.4.6方法，测定MN-1、MN-2和MN-3中红曲霉在波长540 nm下的吸光度值，根据1.4.6中的公式计算淀粉酶活性，结果如表3所示。

表3 不同产品中红曲霉淀粉酶活性

由表3可知，在测定的3种红曲产品中，α-淀粉酶活性产量最高的菌株为MN-1，其淀粉酶活性为10.8 U·g-1；β-淀粉酶活性产量最高的菌株MN-3，淀粉酶活性为13.5 U·g-1；总淀粉酶活性最高的菌株为MN-1，总淀粉酶活性为22.6 U·g-1，菌株MN-2总淀粉酶活性最低。

3 结论

通过采用分光光度法和淀粉酶试剂盒法，对3种红曲霉产品进行色素含量和淀粉酶活性的测定。结果表明，在选取的3种产品中，色素含量最高的菌株为MN-2，最低的为菌株MN-3。α-淀粉酶活性最高的菌株为MN-1，β-淀粉酶活性最高的菌株为MN-3，总淀粉酶活性最高的菌株为MN-1。因此，在生活中，如需选择红曲霉产品用作食品着色剂时，可选择菌株MN-2；如需选择红曲霉提高白酒酿造过程中的原料出酒率，则可以选择菌株MN-1。本实验的开展不仅可以丰富红曲霉理论研究知识，还可为红曲霉在食品和工业上的应用提供参考，具有实际意义。