食品微生物检验常用培养基储存期的研究及探讨

余佳珍，郑小玲，王征南，李 珏

（浙江食品药品检验研究院，药品微生物检测与预警重点实验室，浙江杭州 310052）

培养基富含微生物生长繁殖所需的各类营养物质，是微生物试验的基础，不恰当的制备方法、灭菌程序、贮藏条件等都会影响培养基质量，直接影响微生物试验结果。因此，适宜的培养基制备方法、合理的储存条件，以及质量控制实验是提供优质培养基的保证[1]。《实验室质量控制规范 食品微生物检测》（GB/T 27405—2008）有明确规定，自配培养基应在已验证的条件下储存[2-3]。当前，食品微生物快速检验方法发展如火如荼，但利用培养基对微生物计数、增菌、分离、鉴定仍是现行法规标准规定的主流方法。

脉动真空灭菌器是一种新型的饱和蒸汽灭菌器，由灭菌室腔体、夹套、腔门及密封圈、蒸汽发生器、管路系统、电气系统和控制系统组成。该仪器采用饱和水蒸气作为灭菌介质，经过反复抽真空和注入蒸汽[4]，待灭菌腔体达到一定的真空度后，再导入饱和蒸汽，使蒸汽在腔体内迅速扩散，并渗透到被灭菌物品的深部，从而达到有效的灭菌效果。相比传统的高压饱和蒸汽灭菌器具有蒸汽穿透力强、灭菌效果可靠、灭菌时间短等优点[5]。本实验室购买的ER-2脉动真空灭菌器具有双扉结构，灭菌完成后，被灭菌物品能通过另一扇门无菌转运到洁净区域内，常被用于洁净服、密闭容器、装有液体培养基的密闭容器或其他液体的灭菌。

适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证[6]，为适应食品微生物检验形势的发展，提高检验效率，确保检验质量，本研究选取7.5%氯化钠肉汤、缓冲蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（Lauryl Sulfate Tryptose Broth，LST）这3种食品微生物检验常用液体培养基，采用脉动真空灭菌器进行灭菌处理，在储存期内第0 d、第7 d、第14 d、第21 d、第28 d和第35 d共6个时间点对培养基的pH值、无菌性、质控指标进行考察，规范培养基的配制、灭菌和储存过程，确保实验室配制的培养基可满足食品微生物检验的要求，旨在为实验室日常检验提供可靠有效的培养基储存方案，助力食品微生物检验高质量发展。

1 材料与方法

1.1 培养基

商品化脱水合成培养基：7.5 %氯化钠肉汤（20171020）、缓冲蛋白胨水（BPW）（20171031）、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）（20190121），均购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；胰酪大豆胨液体培养基（1065575），购于广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器设备

ER-2脉动真空灭菌器（瑞士Getinge）；ME2002E电子天平、S400-B酸度计（瑞士Mettler Toledo）；MLS-3780高 压 蒸 汽 灭 菌 器（ 日 本Sanyo）；SF450灭菌箱、IF450恒温培养箱、ICP55低温培养箱（德国Memmert）；生物安全柜（中国力康）；HYC-1378冰箱（中国海尔）。

1.3 菌种

大肠埃希菌（ATCC 25922）、弗氏柠檬酸杆菌（ATCC 43864）、粪肠球菌（ATCC 29212）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 14208）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538），均购于美国菌种保藏中心。

1.4 试验方法

考察指标包括pH值、无菌性检查、质量控制等指标。

1.4.1 制备菌液

按《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》（GB 4789.28—2013），将标准储备菌株接种到10 mL胰酪大豆胨液体培养基中，36 ℃培养24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液制备10倍系列稀释的菌悬液。

1.4.2 培养基制备和灭菌

根据GB 4789系列相关现行标准要求，结合培养基使用说明进行制备，使用脉动真空灭菌器121 ℃灭菌15 min，10 mL试管装月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤采用饱和蒸汽灭菌器121 ℃灭菌15 min。具体内容见表1。

表1 食品常用培养基制备、包装和灭菌方案

1.4.3 储存期验证

将灭菌完成的培养基置于2～8 ℃冰箱避光保存，分别于储存期的第0 d、第7 d、第14 d、第21 d、第28 d、第35 d共6个时间节点对培养基的pH值、无菌性、质控指标进行实验验证。

（1）pH值测定。上述各培养基随机取不少于2份，待恢复至室温（25 ℃）进行pH测定。同一个样品至少进行两次测定，两次测定的结果之差应不超过0.1 pH单位，取两次测定的算数平均值作为结果，pH值测定结果在培养基说明书规定范围内为合格。7.5%氯化钠肉汤培养基配制说明书中规定的pH范围为7.3～7.5，缓冲蛋白胨水规定的pH范围为7.0～7.4，月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤规定的pH范围为6.6～7.0。

（2）无菌性检查。上述各培养基随机取不少于5份，置各培养基对应标准规定的温度培养14 d，结果应为无菌生长，即浊度值应为0（不生长）。7.5%氯化钠肉汤、缓冲蛋白胨水和月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤标准规定的培养温度均为（36 ℃±1） ℃。

（3）培养基质控指标试验。质控指标试验的方法及判定依据为《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》（GB 4789.28—2013）中附录E《实验室使用商品化培养基和试剂的质量控制标准》。

缓冲蛋白胨水（表E.3《非选择性增菌培养基质量控制标准》）：取每罐装量为225 mL的缓冲蛋白胨水2罐，接种不大于100 CFU的鼠伤寒沙门氏菌菌悬液，36 ℃培养不超过18 h，目标菌的浊度值应为2（严重混浊）。

7.5%氯化钠肉汤（表E.4《选择性增菌培养基质量控制标准》）：取每罐装量为225 mL的7.5 %氯化钠肉汤4罐，分别用1 μL接种环接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌工作用悬液（105～107CFU·mL-1）各两罐，36 ℃培养不超过18 h。接入金黄色葡萄球菌的浊度值应为2，接入大肠埃希菌的浊度值应为0（不生长）。

月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（表E.5《选择性液体计数培养基质量控制标准》）：取每管装量为10 mL的月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤6管，分别用1 μL接种环接种大肠埃希菌、弗氏柠檬酸杆菌、粪肠球菌工作用悬液（105～ 107CFU·mL-1）各 2管，36 ℃培养24 h。接入大肠埃希菌和弗氏柠檬酸杆菌的浊度值应为2，且管内有气体，接入粪肠球菌的浊度值应为0（不生长）。

2 结果与分析

2.1 无菌性检查试验结果

无菌性检查试验表明，在35 d内6个时间点对上述培养基进行无菌性检查试验，培养基在对应标准规定的温度下培养14 d，结果均为阴性（浊度值为0，不生长）。见表2。

表2 不同储存时间点各培养基的无菌性试验结果

2.2 pH值测定结果

pH值测定结果表明，在35 d内6个时间点对上述培养基进行pH值测定，各个培养基的测定结果均在说明书规定的pH范围内。见表3。

表3 不同储存时间点各培养基的pH值测定结果

2.3 培养基适质控指标试验结果

培养基适质控指标试验结果表明，在35 d内6个时间点对上述培养基质控指标试验，3种培养基的质控指标试验均符合规定。见表4。

表4 不同储存时间点各培养基质控指标结果

3 结果与分析

3.1 商品化脱水合成培养基的质量管理

新采购的商品化脱水合成培养基应由培养基管理员或其他专业人员对其进行验收和质量控制实验，检验合格后，将培养基进行入库管理[7]。开封后的商品化脱水合成培养基要密封保存，并记录首次开封日期。每次使用前要对内容物进行感官检查，若发现粉末受潮或物理性状发生改变，则不应再使用。配制培养基时，要小心称量，尤其是具有选择性的培养基常含有有毒物质（如胆盐或其他选择剂），必要时佩戴口罩或在通风柜操作，防止吸入有害物质[3]。生产厂家不同，产品批号不同，培养基的质量也会有所不同，培养基的质量控制要做到批检验。

3.2 培养基的制备、灭菌和储存

培养基制备分装完成后，应在其包装容器外表面标明培养基的名称和配制日期，防止使用时混拿混放或未在储存期限内使用。培养基灭菌后要确保密闭保存。①防止水分流失。水分流失会改变培养基中各种营养成分的比例、pH和其外观性状，影响培养基的使用效果。②避免空气中微生物进入引起培养基变质。变质会很大程度改变培养基的有效成分，并破坏培养基的无菌性，变质的培养基不得使用[8]。应对储存培养基的医用冷藏箱进行温湿度监控和记录，当温湿度超过上下限值时，能及时采取控制措施。在储存有效期内的培养基，使用前要先将培养基取出平衡至室温，并对其进行感官检查，如发现培养基变浑浊或性状发生变化，应停止使用，并按实验室相关规程处置，不得随意丢弃。

3.3 脉动真空灭菌器操作要点

灭菌设备及灭菌参数对培养基有较大影响，对于新安装的脉动真空灭菌器，应对其进行安装、运行、性能确认，并定期进行检定及验证。灭菌参数要严格按照各培养基的使用说明进行设定[7]。灭菌前，取一瓶培养基放置在灭菌腔体的“最冷点”，将负载温度探头放在被灭菌培养基液面的几何中心点位置，并固定完好。温度探头测得的温度值要反映被灭菌培养基最深部位的温度，探头测得的温度达到设定的灭菌温度时，开始进入灭菌阶段，待灭菌液体培养基按该装量及包装形式的液体培养基经过验证的装载方式进行装载。灭菌时，培养基的装载量不能超过已验证的最大装载量，装载过密会影响灭菌效果[9]。

3.4 小装量液体培养基灭菌要点

月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤在使用脉动真空灭菌器进行灭菌时，灭菌后培养基的颜色存在异常，进行第0 d质控指标试验时发现，培养基的选择性效果不明显。经研究发现，月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤的包装容器是玻璃试管，且装量少只有10 mL，使得灭菌时温度探头难以固定放置，测量温度不准确，导致实际的灭菌时间和设定的灭菌时间不符，造成培养基灭菌不彻底或过度灭菌，影响培养基质量，所以最终选择传统高压蒸汽灭菌器进行灭菌。保证培养基中营养成分不被破坏，避免培养基中其他物质因高温发生反应而影响其质量[10]。

综上所述，7.5%氯化钠肉汤、缓冲蛋白胨水（BPW）、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）这3种食品常用培养基根据其使用说明及GB 4789系列法规标准要求制备，使用脉动真空灭菌器121 ℃灭菌15 min（10 mL试管装月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤采用饱和蒸汽灭菌器121 ℃灭菌15 min），2～8 ℃避光密闭储存，将储存期限限定在35 d内，培养基的pH值、无菌性及指质控指标均符合规定，可以确保培养基质量。