钙拮抗剂拉西地平杂质B的合成新工艺

＊邹小燕 赖金强 丁家豪

（广州隽沐生物科技股份有限公司 广东 510400）

钙拮抗剂，又可以被称钙通道阻滞药，是指选择性地作用在电压依赖性的钙通道，可以选择性的抑制钙离子从细胞外液经过电压依赖性钙通道进入细胞内的药物分子。由于Ca2+在生物细胞生理及病理中具有很多方面的作用，药物分子可通过对Ca2+活动的影响从而发挥药理作用，细胞内Ca2+增多则可引起ATP消耗增多，线粒体中Ca2+浓度过多，就会破坏ATP的产生，激活磷脂酶和蛋白酶，从而导致细胞机制的丧失以及形态的改变[1]。细胞受到一系列的刺激后，胞浆游离Ca2+离子浓度增高，进而引发一系列生物效应，胞浆游离Ca2+增高一般有两种途径：一是胞外Ca2+内流，二是胞内Ca2+释放。钙拮抗剂可以选择性地与Ca2+离子通道结合，阻滞细胞外Ca2+内流，降低细胞内Ca2+离子浓度，从而发挥药理作用。钙拮抗剂（钙离子通道阻滞剂）的二氢吡啶衍生物，是目前临床上特异性最高、作用最强的一类钙离子通道拮抗剂，目前临床上采用缓释片用药。1967年，德国学者Fleckenstein首次提出“钙拮抗剂”，这类药物的发展十分迅速，在心脑血管疾病治疗领域中占有十分重要的地位与重大意义[2]。钙拮抗剂在缺血性心脏病的治疗上发挥了其重大的作用，特别是二氢吡啶类药物（硝苯地平类药物），涌现了许多新的药物。硝苯地平类药物不仅可治疗心绞痛、缺血性心脏病、改善心肌缺血，而且可以治疗高血压、脑缺血、充血性心力衰竭及外周血管痉挛，目前，此类化合物已经成为治疗心率失常及不同程度的高血压的一线药物[3-5]。此类药物的代表为拉西地平（Lacidipine），化学名称是（E）-4-{2-[3-（1，1-二甲基乙氧基）-3-氧代-1-丙烯基]-苯基}-1，4-二氢-2，6-二甲基-3，5-吡啶二羧酸二乙酯（图1）[6]，在临床使用过程中，具有降压效果好、剂量小、长效、平稳等特点[7-8]，可以用于治疗中轻度高血压。

图1 拉西地平的结构

本品由英国葛兰素Glaxo公司开发，1991年在意大利首次上市，目前已在多个国家销售[9]。拉西地平（Lacidipine）的结构中有一个疏水性的叔丁基侧链片段，这个较大的叔丁基侧链在膜中胆固醇含量较低时，较大的叔丁基侧链能深入到膜的内部。并且，拉西地平（Lacidipine）更倾向于靠近在磷脂双层脂肽链末端的甲基部位，这表明它构象的低能量取向和膜的这个区域在空间容量上的最大化，足以容纳具有疏水性作用的二氢吡啶结构。拉西地平与细胞膜的相互作用是拉西地平（Lacidipine）产生独特药代动力学的关键所在[10]。因此，二氢吡啶的结构破坏了，拉西地平的药理活性也会受到影响。

在药物研究过程中一定要研究杂质的性质，确定它是否会对人体产生影响。药物杂质来源包括两个：其中一个是由于原料不纯、反应转化率不高、杂质未能完全除去等原因导致的，药物生产制作过程中引入的杂质分子。另一个是在贮藏过程中受外界条件影响，比如受到外界微生物的作用，发生水解、氧化、分解、晶型转变、聚合和发霉等变化，产生的杂质。药品研发与生产相关企业必须要对药物里面含有的杂质来源、毒性、分子结构、检测手段及质控限度进一步明确。有关物质在药物的质量研究中占有极为重要的位置，根据有关物质的含量可以计算出药物的纯度，而达到一定纯度有时必须依赖某些必要的操作步骤和原料，因此，微量的有毒物质是被允许使用的，但对这类物质必须严格控制。以文献数据及安全性的检测结果为基础来确认杂质是否有毒。因此，在仿制药的合成过程中，药物杂质的含量控制以及后续杂质的合成是化学药物质量控制的重要内容之一。根据人用药物注册技术要求国际协调会（ICH）的规定，假如，原料药里面有超过0.1%含量的杂质，就要通过谱学等手段鉴定杂质的结构[11-12]。目前，对于拉西地平杂质B的合成少见相关文献报道。为了满足人们对拉西地平（Lacidipine）的生产质量控制需求，依据国际人用药品注册国际协调会（ICH）的杂质限度指导原则要求，我们以拉西地平原料药为原料，通过一步DDQ氧化反应得到杂质B，具体合成路线见图1。

图2

1.实验部分

（1）主要仪器及试剂

Bruck AV III 400MHz NMR核磁共振仪（以d6-DMSO为溶剂，TMS为内标）；WRS-1B熔点仪；Thermo Nicolet iS10 FT-IR红外光谱仪；Agilent 6110 Quadruplie液相色谱-质谱联用仪。

冰醋酸（阿拉丁，AR），乙腈（国药试剂，AR），二氯甲烷（国药试剂，AR），DDQ（阿拉丁，AR），NaI（阿拉丁，AR），浓硫酸（国药试剂，AR），高锰酸钾（阿拉丁，AR），碘（阿拉丁，AR），碘化钠（国药试剂，AR），双氧水（阿拉丁，AR），拉西地平（原料购于南京康满林生物科技有限公司，AR）。

(2)具体实验过程

①拉西地平杂质B的合成

向装有磁力搅拌子的100mL单口圆底烧瓶中加入拉西地平1.0g（455.6，2.2mmol），然后加入30mL二氯甲烷溶液，在室温下以250rpm的速度搅拌，以1.0g/min的速度向圆底烧瓶中加入预先将3-二氯-5,6-二氰对苯醌（DDQ）溶解在二氯甲烷溶液中，在室温下搅拌10min，加入10%的碳酸氢钠水溶液洗涤，加入饱和食盐水（NaCl溶液）洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏除去二氯甲烷，得到粗品，将粗品用2mL乙醇超声溶解，室温搅拌，缓慢滴加入4mL水，然后室温搅拌2.5h，过滤，烘干，得到黄白色固体（杂质B），纯度100%（HPLC），收率89.1%。m.p.=109℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.93(d,J=2.4Hz,1H),7.91-7.41(m,2H),7.13-7.06(m,2H),6.45(d,J=15.6Hz,1H),3.92-3.87(m,4H),2.54(s,6H),1.41(s,9H),0.78(t,J=7.2Hz,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ166.8,165.7,155.6,144.6,141.1,136.5,132.7,129.9,129.7,129.6,127.2,126.4,121.0,80.5,61.5,33.4,28.2；IR:3435,3392,2976,1730,1703,1636,1556,1480,1368,1319,1260,1150,989,767cm-1；MS:m/z calcd for C26H31NO6,[M]+,453.2；found:453.9。

②拉西地平杂质B的合成条件优化

对拉西地平杂质B的合成进行了条件优化，首先我们采用浓硫酸（H2SO4）、高锰酸钾（K2MnO4）、六水合氯化铁（FeCl36H2O）、碘（I2）、NaI-H2O2等氧化剂来代替3-二氯-5,6-二氰对苯醌（DDQ）；同时还对反应的温度和重结晶的溶剂进行优化，最后对重结晶溶剂的比例进行了筛选。

2.结果与讨论

(1)不同氧化剂对反应的影响

在杂质B的合成过程中，需要将二氢吡啶环氧化得到吡啶环，完成这个转化，需要用到氧化剂。考察不同的氧化剂对反应的影响（表1）。通过采用浓硫酸（H2SO4）来代替3-二氯-5,6-二氰对苯醌（DDQ）参与氧化反应时，发现反应完全不能发生，并且还得到了少量的水解的产物，用高锰酸钾（K2MnO4）、六水合氯化铁（FeCl36H2O）来进行氧化的时候，得到了少量的产物，大部分都是原料，没有转化完全，分析原因，我们认为可能是高锰酸钾（K2MnO4）作为氧化剂反应时，在二氯甲烷中的溶解度不好；因此，用醋酸:水（1:1）的体系来代替二氯甲烷，以提高高锰酸钾在反应体系中的含量，但是实验没有得到预期，收率没有明显改善。当采用碘（I2）来进行氧化时，有21%的收率；用NaI-H2O2氧化剂来代替3-二氯-5,6-二氰对苯醌（DDQ）时，以中等收率得到了产物，氧化能力不强，不足以完全氧化二氢吡啶环。

表1 不同氧化剂对反应的影响

因此，通过考察不同的氧化剂，发现3-二氯-5,6-二氰对苯醌（DDQ），能够以75%的收率得到杂质B，其他的氧化剂，比如浓硫酸、高锰酸钾、六水合氯化铁、碘、NaI-H2O2体系，反应效果都不好。

(2)不同温度对反应的影响

通过优化得到最好的氧化剂是3-二氯-5,6-二氰对苯醌（DDQ）之后，开始对反应的温度进行优化，发现温度对反应的影响比较大。首先，我们发现升高温度，反应会变杂，由此推测：①温度太高导致反应条件太剧烈；②没有氩气保护的原因，因此通过实验来进一步验证我们的推测。首先，条件在60℃下氩气（Ar）保护下的反应收率没有得到提高，把反应温度降低，也没有得到预期的效果，因此，我们选择室温下来进行反应（表2）。

表2 不同温度对反应的影响

(3)不同结晶溶剂对产物的影响

在采用3-二氯-5,6-二氰对苯醌（DDQ）作为氧化剂，在室温下反应，以较好的收率得到杂质B之后，如果采用常规的柱层析的方法来进行分离纯化，势必会增加成本。为了工业化的生产，减少成本，对反应后处理的结晶溶剂进行了优化，结果表明，乙醚、丙酮以及丙酮-正己烷溶剂体系都没有固体析出来，二氢吡啶环被氧化得到的杂质B都能很好的溶解在溶剂里面，但是乙醇-水体系有固体析出来，采用乙醇-水体系来进行重结晶（表3）。为研究乙醇-水体系的比例对氧化产物收率的影响，我们对乙醇-水体系的比例进行了进一步的研究。

表3 不同的结晶溶剂对反应的影响

(4)乙醇－水的比例对收率的影响

在实验过程中，我们发现，乙醇-水体系的比例对收率的影响比较大，在乙醇和水的比例在1:2的时候，收率最高，达到了89.1%，水的比例增大和减小都会影响杂质B的收率。同时我们还对杂质B粗品的量进行放大，发现重结晶的量越大，得到的产物收率越高，最高的收率达到97.5%。对得到的杂质B，进行HPLC的分析，通过分析，纯度达到100%以上（C18，70%甲醇：30% H2O），符合质量要求（图3）。因此，通过优化重结晶的溶剂乙醇和水的比例后，得到的最佳的比例条件是1:2。

图3 杂质B的液相谱图

液相条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱）；以甲醇-水-三乙胺-磷酸（600:400:5:1.5）用磷酸溶液（1mol/L）调剂pH值至7.3为流动相，检测波长为284nm，进样体积为10μL，仿照高效液相色谱法（通则0512）测定，避光操作。

3.结论

通过对反应的氧化剂、反应温度，重结晶溶剂的筛选、重结晶溶剂比例的优化，得到的最优条件是，采用DDQ作为氧化剂，缓慢滴加入反应瓶中，搅拌反应10min，采用乙醇-水=1:2的比率重结晶杂质B粗品，上述拉西地平杂质B的新合成操作简单，工艺路线短，产物易于分离纯化，成本低，收率高，适合于工业化生产的需要。