益木脑液灌肠对肝性脑病大鼠脑蛋白表达的影响*

周 烁 周振国 刘昕艳 李京涛 柏鲁宁△

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712046）

肝性脑病（HE）是指由急性或慢性肝功能衰竭引起的中枢神经系统疾病。HE的症状包括个性改变、注意力缺陷、睡眠节律改变、认知障碍，严重时可致昏迷［1］。HE系多因素共同作用的结果，其发病机制尚未明确，目前暂无特效措施，因此，临床急需探索治疗HE临床见效的新药物。已有临床观察［2］表明，由国家级名中医常占杰教授研制的益木脑液可有效改善HE，与西医保守治疗联合应用取得了良好的效果。基于前期课题组研究［3］，本实验采用50% 四氯化碳（CCl4）联合硫代乙酰胺（TAA）建立大鼠肝硬化HE模型，探讨益木脑液对HE脑蛋白的治疗作用及机制，为进一步探讨HE的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性成年SD大鼠72只，质量220～250 g，购于成都达硕实验动物有限公司，合格证号：2020（川）-030，温度20～25℃，湿度60%，昼夜光照时间各12 h，自由饮食饮水。所有实验大鼠操作程序均经陕西中医药大学医学伦理委员会批准实施。

1.2 实验药物 益木脑液：生大黄30 g，蒲公英30 g，石菖蒲30 g，乌梅30 g，煅牡蛎20 g，芒硝20 g。中药均由陕西中医药大学附属医院药剂科统一购买，符合《中华人民共和国药典》（一部）要求，全方药物分别按照比例称重、混合，煎煮、滤过后，经60℃旋转蒸发浓缩，冻干，每克含生药8 g，冻干粉密封保存于4℃冰箱内备用，使用时100℃水溶解。乳果糖（北京韩美药业有限公司，2005005）

1.3 试剂与仪器 TAA（中国医药集团上海化学试剂有限公司，YH21010802）；CCl4（阿拉丁，批号：C128126）；血氨试剂盒（A086-1-1）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（C009-2-1）、血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（南京建成生物工程研究所，C010-2-1）；5-羟色胺（5-HT）试剂盒、去甲肾上腺素（NE）试剂盒（上海联迈生物工程）；GABA抗体、GFAP抗体（武汉博士德生物工程有限公司）。包埋机（武汉俊杰电子有限公司，型号：JB-P5）；石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016）；酶标仪（雷杜生命科技有限公司，型号：RT-6100）；显微镜（Nikon公司，型号：E100）。

1.4 分组及造模 适应性饲养7 d后，在72只SD大鼠中随机选取10只大鼠作为空白对照组，剩余62只大鼠为模型组。参考文献［4］制备肝性昏迷大鼠模型。模型组大鼠按5 mL/kg给予50%CCl4溶剂（50 mL橄榄油+50 mL CCl4）腹腔注射，每周2次，根据体质量变化调整剂量，共12周。第13周按300 mg/kg给予3%TAA溶液隔日腹腔注射，隔天1次，连续2次，对照组大鼠给予等量橄榄油腹腔注射。若大鼠出现嗜睡、反应迟缓，自主活动减少、共济失调、昏迷等症状之一，即可判断造模成功。造模过程中，模型组大鼠死亡17只，对照组未出现死亡。

1.5 给药方法 将第13周造模成功的45只SD大鼠随机分为模型组、乳果糖组和益木脑液低、中、高剂量组，每组9只。乳果糖组以5.63 mL/kg的剂量给予乳果糖灌肠，益木脑液低、中、高剂量组分别以0.56、1.12、2.24 g/kg的剂量给予益木脑液灌肠，对照组及模型组给予等量蒸馏水灌肠，给药体积均按5 mL/kg计，每日1次，连续给药14 d。药物干预过程中，模型组大鼠死亡3只，乳果糖组死亡1只，益木脑液低、中、高剂量组各死亡2、1、1只。

1.6 标本采集与检测 1）血氨、血清生化指标检测。大鼠末次给药结束后，禁食不禁水12 h，次日采用20%乌拉坦（1 g/kg）对大鼠进行麻醉，腹主动脉取血，一部分血液予以肝素钠抗凝，并在0.5 h内检测血氨水平；剩余血液于4℃静置3 h后，以3 000 r/min转速离心，取上清，冻存管分装，-80℃冰箱保存。采用ELISA试剂盒，按试剂盒说明书分别检测ALT、AST、5-HT及NE。2）免疫组织化学。脱颈处死大鼠，冰上取大鼠脑组织，4%多聚甲醛固定。采用免疫组织化学法，通过脱蜡，灭活内源性过氧化物酶，抗原修复，封闭孵育，一抗、二抗、SABC孵育，显色复染，封片，观察GFAP、GABA的表达。

1.7 统计学处理 采用SPSS 21.0统计学软件进行分析，经检验所有数据均符合正态分布，计量数据以（）表示，各组间方差齐，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清ALT、AST、血氨水平比较 见表1。与空白对照组相比，模型组大鼠ALT、AST及血氨水平显著升高，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，乳果糖组及益木脑液低、中、高剂量组都能显著降低大鼠血清中ALT、AST及血氨水平，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。与乳果糖组相比，益木脑液高剂量组中ALT、AST及血氨水平下降明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠血清ALT、AST、血氨水平比较（±s）

表1 各组大鼠血清ALT、AST、血氨水平比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与乳果糖组比较，△P＜0.05。下同。

组别空白对照组模型组乳果糖组益木脑液低剂量组益木脑液中剂量组益木脑液高剂量组n 10 6 8 7 8 8 ALT（U/L）40.4±3.3 120.2±15.2*77.6±12.4*#83.0±10.4*#78.3±8.4*#65.4±14.7*#△AST（U/L）103.2±15.2 233.4±24.5*167.1±19.7*#176.9±20.6*#165.5±14.4*#147.9±22.7*#△血氨（μmol/L）72.5±7.0 166.1±10.0*145.5±9.6*147.3±10.7*#142.9±8.1*#124.9±15.6*#

2.2 各组大鼠神经递质表达水平比较 见表2。与空白对照组比较，模型组大鼠5-HT、NE水平显著升高，且差异具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，乳果糖组及益木脑液中、高剂量组血浆中5-HT、NE水平降低，且差异具有统计学意义（P＜0.01）；与乳果糖组比较，益木脑液高剂量组血浆中5-HT及NE水平显著降低，且差异具有统计学意义（P＜0.01）。

表2 各组大鼠血浆中神经递质表达水平比较（μg/mL，±s）

表2 各组大鼠血浆中神经递质表达水平比较（μg/mL，±s）

组别空白对照组模型组乳果糖组益木脑液低剂量组益木脑液中剂量组益木脑液高剂量组n 10 6 8 7 8 8 5-HT 10.9±1.8 16.9±5.6**12.1±11.6#14.3±8.4 10.6±5.1##7.2±4.7##△NE 1.4±0.5 5.4±1.9**4.6±1.7 5.3±1.8 4.1±1.9 2.8±1.3##△

2.3 各组大鼠脑组织GFAP、GABA蛋白表达比较 在空白对照组中，脑皮层中由GFAP着色所示的星形胶质细胞分布均匀，形态正常；与空白对照组相比，模型组中GFAP着色所示的星形胶质细胞颜色加深，细胞形态出现显著肿胀，说明肝性脑病后大鼠脑皮层组织中的星形胶质细胞出现明显的增殖；与模型组相比，益木脑液给药组GFAP着色数量减少，细胞肿胀程度降低，具有明显改善细胞肿胀和增殖的作用。见图1。

图1 各组大鼠脑皮层GFAP星形胶质细胞表达（200倍）

在空白对照组中，海马内GABA着色所示神经细胞结构完整，分布均匀，排列整齐；与对照组相比，模型组阳性表达增多，海马内神经细胞核固缩变形，染色加深，细胞排列紊乱；与模型组相比，益木脑液组的GABA着色数量下降，具有明显改善神经细胞的作用。见图2。

图2 各组大鼠海马区GABA神经细胞表达（200倍）

3 讨论

HE又称肝昏迷，是肝病晚期常见的并发症和死亡原因，发生在肝硬化患者中的概率达30%～80%，严重影响患者的生活质量［5-6］，其发病机制较为复杂，尚未完全阐明。现如今，氨中毒学说、神经递质改变等研究已较为成熟，外周炎症反应、脑血流量改变、半通道功能障碍等学说也日益受到重视［7］。

HE发生的确切机制尚不完全清楚，但氨作为一种神经毒素是参与HE发病机制的关键。正常情况下，氨主要由肝脏代谢，但在肝功能障碍时，血氨浓度上升，氨随之弥散入脑，与星形胶质细胞胞质内的谷氨酰胺合成酶发生反应，生成谷氨酰胺，谷氨酰胺进入线粒体后又在谷氨酰胺脱氢酶的作用下分解为氨［8］，氨继而促进活性氧-氮簇释放，触发氧化/氮化应激反应，导致线粒体通透性改变，引发星形胶质细胞水肿，GFAP作为胶质细胞的骨架蛋白，是星形胶质细胞特有的胞浆内丝蛋白，能够起维持星形胶质细胞结构和功能的作用，作为星形胶质细胞的特异性标志物［9］，在星形胶质细胞肿胀时可引发其表达上调。同时高氨可诱导星形胶质细胞的蛋白发生酪氨酸硝化反应［10］，使GFAP表达上调，破坏星形胶质细胞的结构和功能，引起星形胶质细胞的水肿，并进一步引发脑水肿，加重HE。研究表明，高氨血在导致星形胶质细胞水肿的同时，亦导致星形胶质细胞膜上多种神经递质的代谢紊乱，如GABA、Glu、5-HT、NE等［11］，引起兴奋性与抑制性神经递质失衡，干扰正常脑活动。5-HT与NE均为真性神经递质，广泛分布于神经系统，5-HT具有平衡中枢神经稳态、调节思维活动等［12］广泛生物学作用，研究表明NE对心理、行为及情绪都有调节作用［13-14］，实验证明［14］，在高血氨影响下，大鼠脑神经核内5-HT转运异常，使5-HT在细胞外液中累积并致使其异常增高，同时由于高血氨的刺激，大鼠脑皮质前NE转运点位消耗增加，转运减少，导致细胞外液的NE浓度上升，引发脑水肿，并进一步加剧HE。GABA为中枢神经主要的抑制性神经传达物质，主要由肠道菌群产生，正常情况下吸收后由肝脏进行代谢，肝衰竭时则可以直接进入体循环，GABA与其他神经递质交互作用，影响运动、体温调节、肌紧张、睡眠、应激等行为［15］，HE时，肝功能异常，血GABA水平升高，GABA入脑增多，中枢神经系统抑制作用增强，进而影响神经传递、运动协调和学习能力［16］。本实验结果表明，益木脑液与乳果糖治疗组均可以改善血氨浓度，使GFAP蛋白表达下调，NE浓度降低。与乳果糖组相比，益木脑液高剂量组的GFAP显著下调，NE浓度明显降低，说明益木脑液有较好的降低血氨、减少肝细胞损害，改善肝脏的功能。益木脑液和乳果糖组的GABA、5-HT表达水平较模型组均有所减少，以益木脑液治疗组改善更为突出，且益木脑液高剂量组与乳果糖治疗组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。说明益木脑液能够醒脑开窍，有效缓解星形胶质细胞肿胀，调节神经递质水平，改善HE症状。

中医学认为，HE属本虚标实之证，是由肝疏泄失常，脾运化功能减弱，气血瘀阻凝滞导致的大肠传导失司、腑气不通，使瘀毒、痰浊、湿热积结于内，浊气上逆，犯于脑窍，进而神机失灵。益木脑液善攻邪泄毒，轻清通窍。方中生大黄活血通经，与芒硝相合可攻邪泻毒以开窍；蒲公英清热解毒；石菖蒲宁神益智，有脑保护的作用，其性温，可以起到防诸药过于苦寒而伤正的作用；乌梅性平，归肝、脾、大肠经，与煅牡蛎同用可收涩固涩，防止泄下过多而伤正。6药并用，温中收敛，苦寒攻下，使浊有所出；脏腑气机宣通，则神明安宁。以上6药合用具有抑菌消炎、减少内毒素，改善肝功能及神经功能的作用［2，17］。本实验也表明，益木脑液在降低血氨水平、调节神经递质等方面具有较为显著的效果，是具有显著治病优势和良好推广前景的有效临床方案。

由于HE系多种致病因素共同作用所致，因此HE临床上具有复杂性、多样性的特点［18］，所以在治疗过程中，应采取多环节、全方面的综合治疗方案［19］。目前治疗HE的临床手段主要为剔除诱因、脱氨、人工肝及肝移植，但各有其局限性［20］，而中医学对HE的治疗有很大的优势，由于中药具有成分复杂的特点，可能存在治疗上的多靶点，在临床应用中也证实中药灌肠［21］对于HE治疗效果明显，因此探究中医药对于HE的治疗是发展趋势之所在。