健脾清肠通络方对三硝基苯磺酸钠诱导重症炎症性肠病肠纤维化小鼠作用机制研究*

郑 烈 闻新丽 段盛蕾

（陕西省中医医院，陕西 西安 710003）

重症炎症性肠病（IBD）是一种发生在胃肠道且原因不明、反复发作的慢性非特异性疾病，病变累及黏膜和黏膜下层，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病2种亚型，是一种致死性肠道疾病，病情缠绵，病程日久，最终继发肠纤维化。内科治疗疗效差，预后不良。肠纤维化被认为是重症IBD不可避免的并发症，可导致肠腔狭窄和梗阻，严重影响患者生活质量［1-2］。由于目前临床缺乏有效的抗纤维化药物，所以大多数患者需要手术治疗。然而目前众多学者对重症IBD的研究主要以炎症、黏膜损伤等研究为主，很少有学者从肠道最终病理结局肠纤维化入手解决临床实际问题。因此，从肠纤维化入手解决临床问题对改变患者病情进展和自然病程具有重要意义。研究肠纤维化的发病机制已成为临床医生的重要挑战，亟须解决。中医学认为，肠纤维化主要与湿热瘀毒等因素有关，当肠道受到上述致病因素后会导致肠腑气机不畅，脉络闭塞，络息成积，久病必有瘀，故导致肠纤维化［3］。故本研究以三硝基苯磺酸钠（TNBS）灌肠诱导的小鼠结肠炎肠纤维化为模型，在前期研究的基础上采用健脾清肠通络方进行干预，该方由地榆散、香连丸、三棱丸方化裁而来，旨在探讨该方对肠纤维化是否具有抑制作用，从而为临床干预肠纤维化提供客观依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级C57/BL6雄性小鼠40只，体质量（20±2）g，饲养于上海中医药大学动物实验中心，室温（23±3）℃，12 h光照和黑暗循环，空气湿度35%～45%。

1.2 药物与试剂

1）健脾清肠通络方混悬液。组方如下：黄芪30 g，黄连3 g，党参15 g，生地榆15 g，马齿苋30 g，白及3 g，木香6 g，三七6 g，三棱12 g，莪术12 g，生甘草6 g。将上述中药浓煎至138 mL，使含生药质量浓度为1 g/mL，低温冰箱保存。2）美沙拉嗪混悬液。药物购于佳木斯鹿伶制药有限责任公司（国药准字H19980148），采用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配置。3）TNBS购于Sigma公司（批号P2297），根据实验需要采用50%的乙醇溶液配置。

1.3 分组与造模

适应性喂养1周后按照体质量编号，随机分为4组：空白对照组（10只）、模型组（10只）、健脾清肠通络方组（10只）和美沙拉嗪组（10只）。除正常组小鼠外，其余3组小鼠均建立TNBS诱导炎症性肠病肠纤维化模型［3］。小鼠禁食24 h不禁水后采用7%水合氯醛（5 mL/kg）腹腔注射麻醉，模型组用直径2 mm的医用聚乙烯乳胶管经肛门轻轻插入肠道内约8 cm，第1日给予5%的TNBS 10 mg，第8日给予5%的TNBS 15 mg，第15日给予5%的TNBS 20 mg，第22日给予5%的TNBS 25 mg，第29日给予5%的TNBS 25 mg，根据实验需要采用50%的乙醇溶液配置成0.8 mL的溶液全部灌入肛内，然后将小鼠尾部提起，倒置60 s，使药液均匀到达全结肠。正常组采用同样的方法注入等体积的0.9%氯化钠溶液。

1.4 药物干预

参照《中药药理研究方法学》［4］，从第22日开始，空白对照组和模型组给予等体积（0.3 mL/d）生理盐水，健脾清肠通络方组给予健脾清肠通络方混悬液15 g/（kg·d）灌胃，美沙拉嗪组给予美沙拉嗪混悬液100 mg/（kg·d）灌胃，给药2周。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 小鼠体质量变化 给药结束时，称取小鼠体质量，并详细记录。

1.5.2 小鼠疾病活动指数（DAI）［5］主要通过动物体质量、大便性状及隐血情况进行评估。

1.5.3 小鼠结肠长度及质量 剪取小鼠全结肠后轻轻平展于滤纸上，测量结肠长度。滤纸上吸干水分后称重。

1.5.4 各组小鼠结肠组织大体评分、病理评分变化比较 剪取小鼠全部结肠，从肛门直肠部开始至回盲部，剪取后小心清除结肠表面的脂肪组织，肉眼观察各组小鼠结肠的大体形态，并参考文献［6］评分。常规石蜡包埋，连续切片，HE染色，参考文献［7］进行评分。

1.5.5 小鼠血清结缔组织生长因子（CTGF）和Ⅲ型前胶原（PCⅢ）表达的检测 分离各组小鼠血清后，低温保存，然后按照ELISA试剂盒说明书（美国Cell Signaling Technology公司，产品货号：3709S，11888S）操作检测。具体方法：收集小鼠静脉血清，12 000 r/min、5 min低温离心，吸取上清液于1.5 mL EP管中，置于-80℃冰箱冻存，以供检测。

1.5.6 小鼠结肠组织转化生长因子-β（TGF-β）蛋白、CTGF、PCⅢ蛋白水平表达 采用Western blotting法检测其表达情况，收集小鼠结肠组织，组织蛋白抽提，测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质转移、显像、免疫检测（封闭1 h，加入稀释好的TGF-β抗体，4℃过夜，TBST洗膜3次，加入二抗，室温孵育1 h，然后TBST洗膜3次），化学发光检测蛋白表达情况。

1.6 统计学处理

应用SPSS23.0统计软件。计量资料以（）表示，对所有符合正态性检验和方差齐性检验的数据，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况分析

见表1。经过4个周期干预后，模型组死亡小鼠4只，健脾清肠通络方组和美沙拉嗪组均死亡2只。与空白对照组比较，模型组小鼠体质量明显减轻（P＜0.05）、DAI评分明显增加（P＜0.05），结肠长度明显缩短（P＜0.05），结肠质量明显增加（P＜0.05）；经健脾清肠通络方和美沙拉嗪干预后，小鼠体质量、DAI评分、结肠长度和结肠质量均有不同程度的改善（P＜0.05），且美沙拉嗪组略优于健脾清肠通络方组（P＞0.05）。

表1 各组小鼠体质量、DAI评分、结肠长度及质量比较（±s）

表1 各组小鼠体质量、DAI评分、结肠长度及质量比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组别空白对照组模型组健脾清肠通络方组美沙拉嗪组n 10 6 8 8体质量（g）23.45±0.21 16.53±0.32*20.95±0.24△21.87±0.19△DAI评分（分）0 6.12±0.78*1.87±0.46△1.26±0.38△结肠长度（cm）8.12±0.09 5.67±0.06*6.82±0.05△7.01±0.03△结肠质量（g）0.65±0.03 1.12±0.06*0.72±0.05△0.69±0.03△

2.2 各组小鼠结肠组织病理变化

见图1。光学显微镜下，空白对照组腺体排列规则，间质内未见炎性细胞。模型组可见溃疡形成，部分区域腺体缺失，间质水肿，嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等大量炎性细胞浸润肌层，并可见纤维细胞增生，间质纤维化。健脾清肠通络方组间质水肿减轻，肌层可见少量炎性细胞，纤维细胞增生和纤维化程度减轻。美沙拉嗪组间质水肿明显减轻，肌层炎性细胞明显减少，可见少量纤维细胞增生和纤维化改变。

图1 各组小鼠结肠组织变化（HE染色，100倍）

2.3 各组小鼠结肠组织和病理组织评分比较

见表2。结果表明，模型组结肠组织大体评分、病理评分均增加（P＜0.05）；与模型组比较，健脾清肠通络方组和美沙拉嗪组小鼠结肠组织大体评分、病理评分均减少（P＜0.05）。

表2 各组小鼠结肠组织大体评分、病理评分比较（分，±s）

表2 各组小鼠结肠组织大体评分、病理评分比较（分，±s）

组别空白对照组模型组健脾清肠通络方组美沙拉嗪组n 10 6 8 8结肠大体评分2.12±0.53 6.25±0.71*4.35±0.54△4.21±0.52△结肠病理评分0 8.45±0.63*5.29±0.47△4.31±0.58△

2.4 各组小鼠血清CTGF和PCⅢ表达比较

见表3。与空白对照组相比，模型组CTGF和PCⅢ表达均增加（P＜0.05）；与模型组比较，健脾清肠通络方组和美沙拉嗪组CTGF和PCⅢ表达均减少（P＜0.05）。

表3 各组小鼠血清CTGF和PCⅢ表达比较（pg/mL，±s）

表3 各组小鼠血清CTGF和PCⅢ表达比较（pg/mL，±s）

组别空白对照组模型组健脾清肠通络方组美沙拉嗪组n 10 6 8 8 CTGF 186.93±22.46 892.04±35.29*306.27±26.78△285.93±22.45△PCⅢ272.56±8.75 365.28±10.42*302.85±7.32△297.36±5.24△

2.5 各组小鼠结肠组织TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表达比较 见图2，表4。与空白对照组比较，模型组结肠组织TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表达增加（P＜0.05）；经健脾清肠通络方和美沙拉嗪干预后小鼠结肠组织TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表达减少（P＜0.05）。

图2 小鼠结肠组织TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表达条带

表4 各组小鼠结肠组织TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表达比较（±s）

表4 各组小鼠结肠组织TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表达比较（±s）

注：与健脾清肠通络方组比较，#P＜0.05。

组别空白对照组模型组健脾清肠通络方组美沙拉嗪组n 10 6 8 8 TGF-β1/β-actin 0.42±0.05 0.91±0.04*0.84±0.03△0.65±0.04#△CTGF/β-actin 0.43±0.05 0.92±0.06*0.75±0.04△0.56±0.12#△PCⅢ/β-actin 0.34±0.06 0.82±0.05*0.54±0.04△0.43±0.07#△

3 讨论

近年来，随着饮食结构的改变，IBD发病率逐渐呈上升趋势，在我国患病人群沿海发达城市为主，由于久病难愈，严重影响患者日常生活和工作。肠纤维化是其并发症之一。多研究表明，反复发作的肠道炎症通过激活间充质细胞并产生细胞外基质（ECM）引发纤维化。在过去的十多年IBD患者肠纤维化并发症并没有得到有效改善，说明肠纤维化的发生发展是非常复杂的，包括炎症和非炎症过程。且目前影响IBD肠纤维化慢性炎症的影响因素尚不清楚，因此，从抗纤维化治疗联合抗炎治疗研究非炎症作用机制是非常有必要的科研课题。然而，利用生物制剂等新药物的抗炎治疗在预防纤维化方面取得进展甚微。一旦ECM开始过度沉积，非炎症机制在纤维化的进展中是不可或缺的，尽管炎症在纤维化过程中仅仅起了很小一部分作用。

肠纤维化表现为过度的、异常的ECM沉积，其中胶原蛋白在ECM表达最丰富［8］。有研究表明［9］，在肠纤维化部位可见大量成纤维细胞，Ⅲ型胶原的合成能力明显增加。TGF-β与纤维化发生发展具有一定关系。有研究表明［10］，TGF-β过度表达会促进ECM大量累积，是肠纤维化重要致病因素。CTGF是多种氨基酸组成多肽物质，对纤维化发生起重要作用。CTGF主要由TGF-β诱导表达，主要介导TGF-β发生纤维化［11］。研究表明［12-13］，在多种纤维化疾病中，TGF-β与CTGF表达协同增加，当CTGF表达减少时，TGF-β促进纤维化作用明显减弱。由此可见，CTGF与纤维化呈相关性。所以通过干预结肠组织TGF-β与CTGF表达研究肠纤维化具有重要意义。

根据叶天士“久病入络”“久痛入血”理进行辨证论治，络脉是气血津液输布、环流的枢纽和通路，主要参与营血的生成、输布和贯通营卫、沟通表里经脉的生理功能。《外科正宗·肠痈论》曰“肠痈，皆湿热瘀血流入小肠而成……如积袭日久……以致毒攻内脏，肠胃受伤”。可见湿、热、瘀、毒是肠炎肠纤维化病理因素，蕴结肠腑，损伤血络，气血运化失司，组织渗灌不足，血败肉腐。吴以岭《络病论》认为络病有“易滞易瘀、易入难出、易积成形”的特点。《灵枢·痈疽》云“荣卫稽留于经脉之中，则血泣而不行，不行则卫气从之而不通，壅遏而不得行，故热，大热不止，热胜则肉腐，肉腐则为脓”。痰湿热毒灼伤络脉导致营卫之行受阻，气机阻滞，引起血液运行涩滞、津血互换异常，使津凝成痰，血滞为瘀，代谢废物蓄积为毒；痰、瘀、毒等病理产物聚积又引起络脉瘀阻、闭塞，络息成积，进一步损伤络脉，加重络脉自身营卫不通，形成络脉病变的恶性循环，故补气健脾药常与清肠祛风、活血通络药同用。前期课题组认为脾气虚弱是发病基础［14-15］，热和瘀是主要病理因素，而且制定了健脾清肠方治疗，疗效确切［16-17］。方中以黄芪和黄连共为君药；党参助黄芪健脾益气，马齿苋助黄连清解肠热止痢为臣药；佐以生地榆清热凉血止血，三七化瘀止血，白及护膜止血，木香理气消胀；生甘草清热解毒，调和诸药。诸药共奏健脾益气、理气止痛、散瘀止血的功效。

由于该病病情迁延难愈，中医认为病邪内蕴与正气消伐并存，属本虚标实。基于以上认识，提出肠纤维化以健脾清肠，活血通络，扶正祛邪为主，创制健脾清肠通络方。该方是在前期健脾清肠方基础上加三棱、莪术，此2味药是三棱丸的重要组成，具有活血化瘀作用，记载于清朝著名医家姚俊的医作《经验良方》。方中三棱苦平辛散，为血中气药，长于破血中之气，具有破血通经之效。现代药理研究［18-20］发现，三棱提取物通过减少纤维组织增生、阻止纤维化发展，促进纤维组织降解起到抗纤维化作用；莪术苦辛温香，入肝脾气分，为气中血药，善破气中之血，具有破气消积之效，且其有效成分姜黄素可通过多种机制和途径介导发挥其抗纤维化作用［21-22］；二药配伍使用，气血双施，活血化瘀、行气止痛、化积消块力彰。三棱与莪术配伍能促进过氧化物酶增殖物激活受体γ生成，降低肠道纤维化因子的生成水平，从而抑制肠纤维化发挥治疗作用。

本研究结果表明，模型组小鼠TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表达增加，经过健脾清肠通络方和美沙拉嗪干预后，结肠组织TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白的表达降低。由此可见，健脾清肠通络方可能通过降低TGF-β 1、CTG、PCⅢ蛋白F表达来抑制肠纤维化。