龙牡汤对急性湿疹大鼠Th1/Th2平衡、肥大细胞及皮肤屏障蛋白表达的影响研究*

迟慧彦 杨 斌 孙洮玉 王晶晶 王清滢 徐春英 陶以成△

（1.中国中医科学院西苑医院，北京 100091；2.北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

湿疹是具有多形性皮损及明显渗出倾向的炎症性皮肤病，临床表现为剧烈瘙痒［1］。急性期湿疹皮损炎症反应及瘙痒发生，不但影响日间学习工作，还可致失眠、睡眠障碍等，严重影响患者的生活质量。我国湿疹患病率约为7.5%，儿童可达到18.71%［2］。湿疹的发病机制复杂多样，目前多认为是在机体内部因素如免疫功能异常、皮肤屏障功能障碍等基础上，夹杂外部因素综合作用的结果。根据病程将湿疹分为急性、亚急性及慢性3期，急性期表现为红斑、水肿乃至水疱，常有糜烂及渗出［3］。龙牡汤是黄尧洲教授治疗湿疹的经验方，临床疗效确切［4-6］，无明显副作用且复发率低，但作用机制尚不清楚。本研究拟通过观察龙牡汤对急性湿疹大鼠皮肤组织病理改变，Th1/Th2免疫平衡，肥大细胞数量及皮肤屏障相关蛋白表达的影响，探讨中药对急性湿疹的防治机理及作用靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

32只SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量220～250 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0001。动物适应性饲养3 d，自由进食标准大鼠饲料，自由饮水和摄食，室温（22±2）℃，湿度（50±10）%。

1.2 试药与仪器

龙牡汤（组成：生龙骨30 g，煅牡蛎30 g，骨碎补10 g，地肤子30 g，连翘15 g），饮片购自中国中医科学院西苑医院，煎制浓缩制成含生药量3.0 g/mL。白芍总苷胶囊（宁波立华制药，国药准字H20055058，规格0.3 g/片）。2，4-二硝基氯苯（DNCB）（天津光复精细化工，批号051001）。大鼠IgE、白细胞介素-2（IL-2）及白细胞介素-4（IL-4）酶联免疫吸附测定试剂盒（伊莱瑞特生物科技有限公司，货号分别为E-EL-RO348c、E-ELRO683c及E-EL-RO595c）；E-caderin抗体（英国abcam公司，货号ab86005，批号GR174855-3）；ZO-1抗体（英国abcam公司，货号ab221547，批号GR2437802-5）；Claudin3抗体（英国abcam公司，货号ab15102，批号GR3637525-3）；酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（北京中杉金桥，货号PV6000，批号2010D1217）；Olympus BX53型显微镜（日本Olympus公司）；Image-Pro Plus 6.0（美国Media Cybernetics公司）。

1.3 分组及造模

将32只SD大鼠随机分为4组，即正常组、模型组、龙牡汤组、白芍总苷组，每组8只。除正常组外，其余组采用DNCB法造模。第1日至第3日为致敏阶段，在大鼠背部涂抹50 μL的5%DNCB，每日1次，第4日至第9日为激发阶段，在大鼠背部涂抹50 μL的0.2%DNCB，每3日1次，共3次，正常组背部涂抹等体积基质溶液。模型建立约10 d，以大鼠皮肤出现红肿、红斑、渗出，挠抓现象，结合血清中嗜酸粒细胞百分比及IgE增高，证实模型成功。

1.4 给药方法

中药组从第10天开始给予龙牡汤灌胃，按大鼠体表面积换算，剂量为30 g/（kg·d），白芍总苷组给予白芍总苷药液灌胃，取药片溶于蒸馏水中，剂量为70 mg/（kg·d）。正常组和模型组以等量生理盐水灌胃。第24天取血后颈部脱臼法处死大鼠，切取相应背部皮肤组织，放入10%中性甲醛液中固定。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 大鼠背部皮肤皮损状况评分 于造模完成当日（第10天）开始，以红斑、丘疹、表皮剥脱、鳞屑等项皮损表现作为皮炎损伤肉眼观察，记录第10天、第14天、第18天、第22天共4个时间点，按照表1标准进行皮损评分。

表1 皮损评分标准

1.5.2 血清IgE、IL-2及IL-4水平 麻醉大鼠，分离一侧颈总动脉，动脉取血5 mL，静置30 min后，3 000 r/min离心10 min，取上层血清保存于-80℃冰箱备用。应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠IgE、IL-2及IL-4的水平。

1.5.3 大鼠背部皮肤组织学观察 中性甲醛液固定皮肤组织48 h，制作成大小为2 cm×1 cm，厚0.3 cm的组织块，脱水、石蜡包埋，4 μm切片，常规苏木素-伊红（HE）染色后，光镜下观察皮肤组织形态学变化。

1.5.4 皮损组织肥大细胞数目 石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇，蒸馏水洗，甲苯胺蓝染液滴染30 min，自来水流水冲洗2 min，滤纸吸干水分，95%～100%乙醇快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察皮肤组织内肥大细胞数量。

1.5.5 免疫组化法染色测定E-cadherin、ZO-1及Claudin3的蛋白表达 石蜡包埋切片，厚度4 μm，烘箱70℃烤片1 h，二甲苯脱蜡，100%-95%-90%-80%梯度乙醇脱水，3%双氧水避光10 min以灭活内源性酶，pH6.0枸橼酸盐修复液高压热修复3 min，分别滴加E-cadherin、ZO-1及Claudin3抗体（浓度分别为1∶200，1∶100，1∶50），4℃孵育过夜；滴加二抗（酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物），常温孵育30 min，DAB显色，镜下控制反应时间，染色完成后自来水冲洗，苏木素复染，80%-90%-95%-100%梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察，阳性为表皮细胞胞浆内棕黄色颗粒，阴性对照用PBS代替一抗，每张切片随机取5个高倍视野（400），Image-Pro Plus 6.0软件测定阳性信号的平均光密度（IOD）值。

1.6 统计学处理

应用SPSS25.0统计软件。符合正态分布的计量资料以（）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠各时间点背部皮肤皮损状况评分

见表2。与正常组相比，模型组大鼠皮肤皮损评分增加（P＜0.05）；与模型组相比，龙牡汤组及白芍总苷组皮损评分呈下降趋势，各时间点部分结果差异存在统计学意义（P＜0.05），说明龙牡汤有改善炎症和修复皮肤损伤的作用。

表2 各组大鼠各时间点背部皮损评分比较（分，±s）

表2 各组大鼠各时间点背部皮损评分比较（分，±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组别正常组模型组龙牡汤组白芍总苷组n 8 8 8 8 10 d 2.07±0.54 9.46±1.73**9.59±1.62 9.80±1.96 14 d 2.14±0.56 10.01±1.79*8.39±1.98 8.74±2.14 18 d 2.17±0.49 10.66±1.83*7.48±1.45△7.68±1.50△22 d 2.01±0.68 10.82±2.03*7.03±1.39△7.43±1.43△

2.2 各组大鼠血清IgE、IL-2及IL-4水平比较

见表3。与正常组比较，模型组大鼠血清中IgE、IL-4明显上升，IL-2水平下降，差异均存在统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，龙牡汤组及白芍总苷组血清IgE、IL-4水平减低，IL-2增高，IL-4差异存在统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组大鼠血清IgE、IL-2及IL-4表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠血清IgE、IL-2及IL-4表达水平比较（±s）

组别正常组模型组龙牡汤组白芍总苷组n8 8 8 8 IgE（U/mL）3.27±0.54 5.88±0.79**4.12±0.62**4.39±0.73**IL-2（ng/mL）78.44±9.35 57.01±11.08*62.32±9.85 64.04±10.32 IL-4（ng/mL）49.47±6.63 88.62±10.33*65.21±9.39△73.34±10.21△

2.3 各组大鼠皮肤组织形态学变化

光镜下观察可见：正常组大鼠皮肤组织如常，上皮层数未见增加，细胞未见变性，真皮层为疏松的纤维结缔组织，见少量血管及散在少量炎细胞；模型组大鼠表皮呈乳头状增生，棘层肥厚，上皮细胞水肿变性，间质血管增生，扩张、充血，炎细胞浸润明显。龙牡汤组和白芍总苷组皮肤组织损伤均有明显减轻，特别是龙牡汤组表现为上皮细胞水肿减少，间质炎症程度减轻。见图1。

图1 各组大鼠皮肤组织病理形态（HE染色，100倍）

2.4 各组大鼠皮肤组织肥大细胞数量

甲苯胺蓝染色法示肥大细胞位于皮肤组织真皮浅层，形状不规则，散在排列，胞质呈深蓝色空泡状。在100倍数视野下，统计各组肥大细胞数目。结果显示：与正常组（3.81±0.97）个比较，模型组肥大细胞为（11.02±2.23）个，较为密集，数量增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。龙牡汤组为（7.21±1.42）个，白芍总苷组为（7.64±1.83）个，两组均较模型组显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠皮肤组织肥大细胞数量改变（甲苯胺蓝染色，100倍）

2.5 各组大鼠表皮组织E-cadherin、ZO-1及Claudin3的蛋白表达

上皮屏障蛋白E-cadherin、ZO-1及Claudin3在各组大鼠皮肤组织均有表达，主要定位在表皮角化形成细胞的胞浆及胞膜。结果显示：与正常组比较，模型组E-cadherin、ZO-1及Claudin3表达水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。龙牡汤组E-cadherin、ZO-1表达水平较模型组显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3，表4。

图3 各组大鼠表皮E-cadherin、ZO-1及Claudin3免疫组化蛋白表达（IHC，200倍）

表4 各组大鼠表皮E-cadherin、ZO-1及Claudin3蛋白表达比较（IOD值，±s）

表4 各组大鼠表皮E-cadherin、ZO-1及Claudin3蛋白表达比较（IOD值，±s）

组别正常组模型组龙牡汤组白芍总苷组n8 8 8 8 E-cadherin 1 035±124 755±143*873±109△820±129 ZO-1 1 123±145 668±151*807±122△798±144△Claudin3 863±97 635±137*707±101 694±108

3 讨论

湿疹为常见的免疫炎症性皮肤病，据统计，发达国家约有15%～20%的人口患有湿疹［7］。急性湿疹是湿疹常见临床类型之一，属于迟发型变态反应，在变应原诱导下，血管扩张，通透性增高，渗出增加导致组织水肿，同时肥大细胞数目增多、活化，嗜酸粒细胞浸润增加［8］。临床症状为红斑、丘疹和水疱，乃至渗出及糜烂，组织病理表现为皮肤的表皮、真皮结构有不同程度的破坏、损伤，表皮为角化过度，棘层肥厚，严重时表皮变性、坏死、脱落，糜烂及溃疡形成，真皮层组织水肿及嗜酸粒细胞、肥大细胞大量浸润等［9］。本次实验从组织病理结构层面观察发现，湿疹模型组大鼠表现为皮肤表皮组织增生，棘层肥厚，局部上皮细胞排列松散，角质层可见灶性糜烂，间质血管扩张充血，炎症浸润明显；同时免疫组化染色发现，真皮浅层肥大细胞数量增多。而在给予龙牡汤干预后，结果显示表皮层数减少，糜烂及炎症减轻，肥大细胞数目减少。

急性湿疹发生机制复杂，目前研究热点主要集中于机体内部因素，认为免疫功能异常和皮肤屏障功能障碍是急性湿疹发病的关键因素［10］。Th2细胞因子在IgE介导的免疫炎症中起中心作用，Th2细胞分泌的IL-4、IL-5、IL-13可诱导B淋巴细胞产生IgE，间接活化肥大细胞。细胞角质层细胞结构蛋白异常可导致皮肤屏障功能障碍，临床表现为皮肤干燥，对外界刺激敏感，使得变应原更容易透过皮肤，诱发级联免疫炎症反应，加重病情。E-cadherin属于钙离子依赖黏附素家族，ZO-1及Claudin3为紧密连接蛋白家族分子，均起封闭屏障作用，可防止溶液中分子沿细胞间隙渗入体内，保证内环境的相对稳定［11］。Owsiak等［12］揭示了细胞因子对细胞黏附分子、紧密连接蛋白等功能性皮肤屏障的影响。实验给予白细胞介素-17诱导角质形成细胞，发现丝聚蛋白mRNA水平显著降低，此外，参与细胞黏附的基因包括E-cadherin、ZO-1表达也降低。本次实验发现，与正常组比较，急性湿疹大鼠血清中IgE、IL-4水平增加，IL-2下调，龙牡汤则对于IgE、IL-4水平有明显的提升作用。此外，作为表皮屏障的客观标志，E-cadherin、ZO-1及Claudin3在湿疹大鼠皮肤组织上的蛋白表达均受到抑制，而龙牡汤能够有效改善此状况，显著升高E-cadherin、ZO-1的表达。

中医归湿疹为“湿疮”“浸淫疮”“绣球风”范畴，认为［13］湿疹发病主因先天禀赋不耐，皮肤腠理不固，外界风、湿、热邪侵袭而发病。后天饮食不节，过食辛辣鱼腥动风之品，伤及脾胃，脾失健运，致湿热内生。内外合邪，两相搏结，蕴结肌肤。其病因病机大多归于风湿蕴热、脾虚湿盛、血虚风燥等，治疗上多以清热祛风、健脾利湿、养血润燥等为主。而黄尧州主任医师在40多年的临证治疗湿疹中发现，湿疹患者的主要特征是顽固性瘙痒，但痒易扰心神，因此患者多伴有失眠、烦躁、情绪加重等证候，因此根据《素问·至真要大论》中病机十九条所言“诸痛痒疮，皆属于心”，创新性地提出了“从心论治”湿疹的治疗方法，创立了以龙牡汤为主方的镇心安神法治疗湿疹方案［14］，取得了良好的临床疗效。该方以3味药为主，为生龙骨、煅牡蛎、骨碎补。方中重用生龙骨为君、煅牡蛎为臣，共奏重镇心安神、益阴潜阳之功；骨碎补能补先天禀赋之不足，佐助君臣。诸药合用，药少力专，心神宁、瘙痒止。以3味药为基础方，临床可以加减运用。现代医学认为龙牡汤中所含主药生龙骨、煅牡蛎含有大量钙盐，骨碎补能够促进机体对钙吸收，3药合用能提高血钙浓度［15］，有利于降低毛细血管通透性，减少血浆渗出，从而抑制炎症反应；同时钙质还可降低神经兴奋性和机体敏感性，提高机体的耐受能力。

《灵枢·本神》云“心藏神”，《素问·至真要大论》所云“诸痛痒疮，皆属于心”。唐王冰曰“心寂则痛痒微，心躁则痛痒甚，百端之起，皆自心生，痛痒疮疡生于心也”。说明了心神不安、心燥可以导致痛痒更甚，也明确指出了心神和和湿疹严重程度的密切关系。隋代巢元方在《诸病源候论》中也明确提出“浸淫疮，是心家有风热，发于肌肤”，说明了心火旺盛、心家有风热可以导致浸淫疮。中医基础理论认为“心主神志、心主血脉”。《素问·灵兰秘典论》有云“心者，君主之官，神明出焉”。从心论治法采用镇心安神以去心火、安神明，使血脉通顺，气血畅行，心神安定，邪风得除，痒亦可止。从现代医学的角度来看，镇心安神方可以改善患者睡眠以及躁动不安、注意力不集中等症状，并且减轻皮肤炎症，提高患者的生活质量。本方不拘泥于传统健脾、清热利湿、养血润燥等治疗方法，而重视心神的调养，立法以镇心安神为主，又不乏清心祛火、止痒补肾之义，药少力专。

综上所述，本实验说明龙牡汤能够显著调节湿疹急性期大鼠免疫炎症状态，纠正内外免疫紊乱，改善上皮组织损伤，增强皮肤屏障功能，从而达到减轻瘙痒、预防复发的目的。