中药干预足细胞上皮间质转分化治疗糖尿病肾病的研究进展

2022-10-11王婉懿王悦芬

环球中医药 2022年10期

王婉懿王悦芬

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的严重微血管并发症，中国糖尿病患者中20%～40%合并DN，是导致慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)及终末期肾脏病(end stage renal disease，ESRD)的首要原因[1]。研究表明，足细胞损伤是引起蛋白尿和肾小球硬化的关键因素，在DN的发生和发展中起重要作用[2]。足细胞上皮间质转分化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)是指上皮细胞失去其标志性的表型特征，转化为具有间充质表型细胞的过程，伴随细胞形态的改变和上皮细胞功能的缺失。主要表现为足细胞标记蛋白如Nephrin、ZO-1、podocin、P-cadherin等表达下调；间充质细胞表型标志物如desmin、α-SMA、FSP-1、纤连蛋白(fibronectin)、I型胶原(collagen I)、N-cadherin、波形蛋白(vimentin)及转化因子(如Snail、MMP-3、MMP-9)等表达上调[3-4]。现将与糖尿病肾病EMT相关的7条信号通路进行综述(如图1)。

1 中药干预TGF-β信号通路治疗DN的机制研究回顾

转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)主要依靠以Smads和丝裂原活化蛋白激酶为主的信号通路发挥其生物功能。非活性状态下，TGF-β1与TGF-β1结合蛋白非共价结合。当受到理化因素刺激时，TGF-β配体、TGF-β II型受体二聚体和TGF-β I型受体二聚体结合形成复合物，对TGF-β-I型受体的GS结构域和丝/苏氨酸残基磷酸化，形成TβR-II-TGF-β1-TβR-I异源三聚体，引起下游转录因子Smad2和Smad3的磷酸化[5]。磷酸化的Smad2/3与Smad4结合并易位到核中与靶基因结合[6]。Smads的核易位还可上调细胞核内结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)的转录，可能是导致机体内所有组织器官纤维化的关键因子。

图1 糖尿病肾病足细胞EMT相关信号通路传递过程

研究表明，高糖等刺激因素可引起足细胞TGF-β、Smd2/3水平上调，Smad7表达下调，引起足细胞损伤。经典益气类中药黄芪和人参，其主要成分多糖类、皂苷类、黄酮类等在抗氧化、清除自由基和脂质过氧化物等方面有重要作用。Mao等[7]研究发现，黄芪甲苷IV可降低miR-192和TGF-β1、Smad3和肌动蛋白α、I型胶原蛋白等纤维化相关蛋白的表达，而Smad7的表达明显增加，并呈剂量依赖性地减轻高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖，其机制可能是通过TGF-β1/Smad/miR-192通路抑制肾纤维化的产生及系膜细胞的过度增殖。Li等[8]发现黄芪多糖可抑制TGF-β1/Smad信号通路，调控其下游信号分子，升高MMP-2、MMP-9的表达，并降低TIMP-1、TIMP-2的表达，最终可减轻肾脏纤维化损伤。Du等[9]分别使用人参皂苷Rg1、黄芪甲苷IV和两药联用干预糖尿病肾病大鼠，结果显示，三组都能降低TGF-β1、Smad2/3和CTGF表达水平，增加Smad7的表达，人参皂甙Rg1和黄芪甲苷IV联用组效果最好，由此发现，人参和黄芪均可通过调控TGF-β信号通路抑制足细胞EMT，保护足细胞，且两药协同作用效果更好。茯苓同样具有益气健脾，利水渗湿的作用。Wang等[10]通过观察茯苓酸ZA干预TGF-β1和AngII诱导的HK-2细胞和足细胞，发现PZA通过阻断Smad2/3-TGF-βRI蛋白相互作用而抑制Smad2/3磷酸化，从而抑制RAS，抑制活化的RAS和TGF-β/Smad信号通路，上调足细胞标志物的蛋白表达，减轻足细胞损伤。大黄是糖尿病肾病的经典用药，对肾脏的保护作用有效成分主要为大黄素、大黄酸、大黄酚，能明显改善糖尿病患者肾功能，减轻肾小球高滤过，减少蛋白尿。Guo等[11]发现大黄酚可下调Smad2/Smad3、p53的表达，通过失活TGF-β/Smad信号通路抑制DN的进展。

TGF-β是EMT最经典的信号通路，目前关于DN的研究大多选择作用于Smad2/3信号靶点，而Smad7蛋白对TGF-β/Smads通路具有负性调控作用，进一步研究中医药对于Smad7和CTGF的干预作用同样具有价值。TGF-β信号通路为新型药物研发提供了很多思路和方向，如抑制TGF-β1的产生，抑制Smad磷酸化、P38MAPK磷酸化等，以及阻断TGF-β信号通路对机体是否有其他不良影响尚需探讨。

2 中药干预Wnt/β-catenin信号通路治疗DN的机制研究回顾

Wnt/β-catenin信号通路与多种慢性肾脏病、癌症、骨质疏松等相关[12]。正常情况下，β-catenin与APC、Axin、CK-1、GSK-3β形成结构复合物，被CK-1和GSK-3β磷酸化失活[13]。当足细胞受到高糖或TGF-β等刺激时，胞外Wnt配体可与跨膜蛋白Frizzled受体和共同受体LRP5/6组成的复合受体结合形成二聚体。Wnt-FZD-LRP5/6复合物激活下游散乱蛋白Disheveled，并与支架蛋白Axin结合，抑制GSK-3β磷酸化β-catenin，阻断了β-catenin降解，蓄积在细胞质中的β-catenin进入细胞核，与TCF/LEF结合，特异地启动和激活下游靶基因Snail等的转录[14-15]。

丹参作为经典的活血化瘀类中药，其主要活性成分为酚酸类和二萜醌类。Xiang等[16]利用丹参提取物干预高糖/高脂饲料喂养DN模型大鼠后发现，丹参提取物显著降低了大鼠肾脏组织中Wnt4、β-catenin和TGF-β的高表达，并改善肾小管上皮细胞空泡变性、糖脂代谢紊乱、炎性细胞浸润等症状。刘娇娇等[17]研究表明丹参能通过抑制Ang II诱导的系膜细胞Wnt/β-catenin信号途径活化，使Wnt1、β-catenin、PAI-1表达与FN合成水平明显下降，从而发挥抗肾小球硬化的作用。故推断，丹参可以通过调控Wnt/β-catenin、TGF-β信号通路抑制足细胞EMT过程，改善肾间质纤维化，达到治疗DN的目的。同样机制的还有黄酮类化合物白藜芦醇，研究发现白藜芦醇可显著降低糖尿病肾病大鼠肾组织Wnt4、β-catenin、TGF-β1、Smad2/3 mRNA及蛋白表达[18]。雷公藤具有多种免疫抑制作用和非特异性抗炎作用,是目前中药治疗肾脏疾病最有效的药物之一。Chang等[19]研究表明雷公藤显著降低了大鼠肾脏中Wnt-1、β-catenin、NF-κB-p65、GSK-3β和TGF-β1 mRNA和蛋白水平，雷公藤对糖尿病大鼠的肾脏保护作用呈剂量依赖性，与厄贝沙坦治疗相比有改善作用。Shi等[20]发现雷公藤甲素可明显降低HG诱导的足细胞Wnt3α和β-catenin的高蛋白表达水平，抑制Wnt3α/β-catenin信号通路的激活。大黄具有清热、祛瘀等功效，其主要提取物之一大黄酚已被证明对足细胞EMT有显著抑制作用[11]，其另一提取物大黄酸被证明可下调Wnt1、p-GSK-3β/tGSK-3β、p-β-catenin/tβ-catenin的表达，抑制足细胞EMT[21]。

现阶段，对于Wnt/β-catenin通路的上游Wnt、GSK-3β及下游β-catenin靶点作用的研究逐渐增多，对Wnt/β-catenin信号通路的研究多集中在Wnt1和Wnt4蛋白，对其他家族成员的研究相对较少，进一步研究中药干预Wnt/β-catenin通路的作用可以获得更有价值的研究结果。

3 中药干预ILK信号通路治疗DN的机制研究回顾

整合素连接激酶(integrin-linked kinase，ILK)作为蛋白激酶时，ILK参与integrin介导的过程，可受TGF-β1信号通路的调节，同时也是TGF-β1信号通路必需的下游信号靶点。当足细胞受到有害刺激时可激活ILK，进一步引起下游AKT、p38 MAPK及GSK-3β磷酸化，从而抑制β-catenin磷酸化。

齐墩果酸是滋阴类中药女贞子的主要提取物之一，临床上作为一种广谱抗菌药使用，具有抗炎、细胞保护等作用。He等[22]发现齐墩果酸干预可以剂量依赖性的方式逆转E-cadherin的下调和α-SMA和纤维连接蛋白的上调，还能恢复由TGF-β1启动的Nrf2和klotho的表达，降低Smad2/3、ILK和Snail的磷酸化。陈皮具有理气健脾的功效，其有效化合物之一橙皮素有抗炎、抗氧化等药理作用。Zhang等[23]发现橙皮素可抑制STZ糖尿病肾病小鼠肾组织TGF-β1、ILK、Akt的表达，保护足细胞，延缓DN。益气活血药红景天在临床中常用于治疗DN，主要提取物为红景天甙。Lu等[24]用红景天甙干预葡萄糖处理的足细胞，发现红景天甙提高了p-Akt、p-ILK、p-JNK、p-ERK的表达水平和Nrf-2的定位，显著减少了ROS的生成和Caspase9/3的表达，红景天甙通过抑制足细胞EMT和氧化应激以减少足细胞损伤。

目前，中药调控ILK信号通路主要通过干预ILK及其下游的intergin表达，未对其它具有可调控作用的蛋白、因子进行研究，存在一定的单极化现象，深入研究中药干预其他信号靶点如GSK-3β的表达，可以开发出干预EMT更为有效而安全的中药制剂。另外，整合素介导的ECM与细胞和细胞与细胞之间的黏附作用平衡也是中医药可进一步挖掘研究的目标。

4 中药干预Notch信号通路治疗DN的机制研究回顾

Notch信号通路与TGF-β通路存在交互协同的作用，是TGF-β1介导足细胞EMT所必需的部分。以往研究认为，Notch通路需要TGF-β通过smad3才能被激活。但近年研究显示，Notch信号通路更趋向于是一个独立的信号通路。Notch和Snail2的相互作用，对于Notch介导的E-cadherin或P-cadherin的抑制和β-catenin的激活是必需的。在理化因素的刺激下，Notch配体Jagged1与邻近受体Notch1的结合，暴露蛋白水解酶的酶切位点，从而发生两次水解，释放出Notch受体胞内段，易位至细胞核内。与CSL蛋白结合后，诱导转录因子Snail、Hes或Hey与P-cadherin结合，进而使足细胞发生EMT。研究发现，Wnt1的缺失可引起Notch1及其转录靶点Nrarp上调，足细胞FoxC2受到抑制，Hey2表达上调[25]。

治疗DN的常用清热类中药黄芩、黄连，其有效成分黄芩苷、黄连素在肾脏中有抗纤维化的作用。Dou等[26]发现黄芩苷可降低Noch1的活性及其下游Snail的表达，从而抑制Notch1-Snail轴介导的足细胞EMT，从而减轻阿霉素诱导的局灶性节段性肾小球硬化和蛋白尿。Yang等[27]发现黄连素抑制了DN模型KKAy小鼠Notch/Snail通路的激活，上调了α-SMA和E-cadherin水平，降低了jagged1、Notch1、hes1和Snail1的蛋白和mRNA表达水平，保护足细胞。姜黄是治疗肾脏病常用的活血药。祖宁辉等[28]的研究表明用姜黄素干预显著下调了UUO大鼠的血清BUN、Scr水平、24小时尿蛋白水平及肾组织Notch1、Jagged-1蛋白相对表达量,且实验组低于模型组。姜黄素可通过调节UUO大鼠肾功能指标的水平，进而改善肾间质纤维化，其作用机制可能与下调肾组织Notch1和Jagged-1蛋白表达，抑制Notch通路的信号转导相关。

目前中药作用于Notch信号通路主要通过抑制Notch及其配体Jagged的水解激活实现。现代医学对Notch通路介导的关键蛋白和非编码RNA的研究进展颇大，中医药可以此为靶点深入进行研究，进一步了解中医药在治疗DN中的机制。

5 中药干预MAPK信号通路治疗DN的机制研究回顾

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)有p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)两个亚类。TGF-β活化后可激活MAPKKK、MAPKKK磷酸化并激活MKK3/4/6，从而双重磷酸化p38MAPK和JNK，其中MKK3/6可特异性激活p38，MKK3/6也可以在凋亡因子的刺激下被凋亡信号调节酶1直接激活。p38MAPK和TGF-β1起协同作用，一方面p38 MAPK可增强TGF-β1的活性；另一方面，TGF-β1可以使p38MAPK自磷酸化，并激活其下游转录因子环状单磷酸腺苷结合蛋白[29]。

常用于治疗DN的经典药对地黄和山茱萸中，地黄滋阴以补为主，山茱萸敛阴以收为主，合用可益肾强精，大补元气。Chen等[30]通过使用治疗DN的药对地黄和山茱萸的主要活性成分梓醇和马黄酮调控晚期糖基化终末产物诱导的KK-Ay小鼠自发DN和足细胞损伤模型，发现梓醇和马黄酮单独或联合抑制足细胞RAGE/p38 MAPK/p65 NF-κB和RAGE/Nox4/p65 NF-κB通路的激活。联合用药的抑制作用比单独用药的抑制作用更明显。先前研究表明，袪风湿药雷公藤的另一提取物雷公藤红素有强抗氧化和抗炎作用[31]。Zhang等[32]发现雷公藤红素可降低糖尿病大鼠血肌酐和尿素氮含量，减少尿蛋白排泄，改善肾脏病理损伤，下调p38MAPK和NF-κB p65的表达。丹酚酸B作为活血化瘀药丹参的多酚酸类主要活性成分，具有调控TGF-β1/Smad信号通路和活化p38MAPK的作用，抑制高糖诱导的肾脏细胞表型转化，减少Col I和Col III等细胞外基质分泌，减轻炎症反应[33]。

现阶段发现在动物模型中MAPK相关蛋白激酶抑制剂对足细胞EMT有一定的抑制作用，但由于其临床耐受性及其毒副作用等进一步研究受限。中药治疗多靶点、多环节、不良反应少，因此需深入研究中药干预MAPK信号通路，抑制足细胞EMT。

6 中药干预NF-κB信号通路治疗DN的机制研究回顾

核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)在细胞质中与抑制性IκB结合在一起处于稳定状态。理化因素刺激下，IKK复合体(NEMO、IKKα、IKKβ)被激活，促进IκB磷酸化和泛素化水解后释放出p65/p50并移位至胞核中，与靶基因结合位点即启动子或增强子结合诱导COX-2、MMPs、VEGF，以及最重要的转移诱导物Snail等转录，促进足细胞EMT[34]。

经典补气类中药黄芪和黄芪主要活性成分分别为黄芪甲苷IV和当归多糖。Wang等[35]观察到在高糖诱导的小鼠永生化足细胞中，黄芪甲苷IV可抑制TGF-β1表达，并可激活SIRT1-NF-κB通路，抑制高糖诱导的足细胞EMT。当归多糖[36]可下调糖尿病肾病大鼠肾组织中NF-κB mRNA和蛋白表达水平。化痰止咳平喘药罗汉果的一种新型多糖提取物(SPG-1-1)可下调G蛋白偶联细胞膜受体TLR4及其下游蛋白激酶(NF-κB p65)的mRNA和蛋白表达。通过调节炎症，抑制TLR4-NF-κB通路，刺激超氧化物歧化酶的产生，减少细胞因子(IL-6、TNF-α)和丙二醛的产生[37]。

目前，关于NF-κB信号通路的研究多基于炎症反应干预，对其参与足细胞EMT的研究较为不足。研究中药对其相关受体、信号转导、负反馈调节等都需要更深入的研究。

7 中药干预PI3K/Akt信号通路治疗DN的机制研究回顾

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)对机体的糖脂代谢有显著的调节作用。理化因素刺激下，活化的PI3K可特异性地将磷脂酰肌醇2磷酸(PIP2)催化为PIP3，PIP3协同磷酸肌醇依赖的激酶-1(PDK-1)可诱导Akt发生三级结构构象改变并聚集到胞膜，Akt的Thr308及Ser473位点被磷酸化。完全活化的Akt将信号传导至mTOR，从而激活下游相关信号因子等。PTEN可将PIP2重新催化为PIP3，从而抑制PI3K/Akt信号通路。

清热药黄连提取物黄连素是抑菌抗炎的主要有效成分。刘青等[38]发现黄连素能明显升高HG诱导的足细胞nephrin、WT-1蛋白的表达，降低PI3K、p-Akt、Bim蛋白的表达，明显升高p-FOXO1蛋白的表达。Wang等[39]研究发现黄连素可以减轻来自高糖诱导肾小球系膜细胞外泌体所导致的足细胞的损伤，其机制可能与TGF-β1以及PI3K/Akt信号通路相关。姜黄具有活血行气的功效，有效成分姜黄素具有较好的抗炎和抗癌特性。Tu[40]等发现姜黄素可上调DN大鼠和MPC5细胞E-cadherin和LC3蛋白的表达，下调Vimentin、Twist1、p62、p-mTOR、p-Akt和P13K的表达。既往研究已证明，袪风湿药雷公藤提取物雷公藤红素能抑制MAPK和NF-κB信号通路主要信号因子的表达。Nie等[41]发现大剂量雷公藤红素[1.5 mg/(kg·d)]上调了LC3II和nephrin的表达，下调PI3K、p-AKT mRNA、NF-κB和mTOR mRNA的表达。雷公藤红素通过抑制PI3K/Akt信号通路，下调NF-κB的表达，抑制GBM增厚，并减少mTOR的表达，保护足细胞，减轻糖尿病肾病肾损害。

PI3K/Akt通路被认为是经典的信号通路之一，与多条通路交叉影响。国外关于药物机制的研究大部分已涉及到非编码RNA、外泌体等深入分子机制层面，目前国内中药研究较少，后期无进一步的深入研究。因此发挥中医药优势，深入探索中医药干预PI3K/Akt及其交叉通路的分子机制十分必要。

8 小结与展望

通过对相关中药证型进行整理分析，发现在调控足细胞EMT的中药单体和单味中药中，滋阴类中药地黄、女贞子等；益气类中药黄芪、人参、茯苓等；补肾类中药山茱萸、女贞子、地黄等；活血化瘀类中药当归、姜黄、丹参、红景天等；清热类中药黄芩、黄连、生地黄、大黄等，都分别对DN足细胞EMT不同信号通路靶点有阻断、抑制的作用。对上述药物分析后发现，靶向干预足细胞EMT信号通路防治DN的中药大多具有益气养阴、清热祛湿、活血化瘀的功用。

目前关于中药干预足细胞EMT的研究仍存在问题：首先，目前的足细胞EMT信号通路研究多为“有效成分—单一通路”形式，但临床上中药单体多数可以同时作用于多靶点调控信号通路，如雷公藤可调控Wnt/β-catenin、MAPK、NF-κB、PI3K/Akt等信号通路抑制足细胞EMT。因此未来需深入研究中药调控多个信号通路间的联系及其协同作用以抑制足细胞EMT的具体机制；其次，目前对于中药调控足细胞EMT的研究大多是从药理学角度进行研究，缺乏中医证候学模型实验及临床试验研究，在临床中根据中医辨证指导用药可以使中药及其有效成分产生更大的价值。因此在下一步的研究中，应当考虑将DN辨证分型和中药性味归经、功效主治等方面相结合进行研究，为中药治疗DN提供有力的客观依据。

本课题组前期研究发现，AGEs-RAGE轴为DN伏邪论提供了证据，内生伏邪与肺脾肾和三焦有关，导致湿痰瘀互结之邪伏于肾之膜原[42]。此过程与足细胞EMT活化，ECM沉积，肾小球基底膜增厚，最终肾纤维化的西医病理过程相似，本课题组试提出“伏邪—EMT—肾纤维化”相关性假说。基于此假说自拟的保肾方被证明能显著抑制高糖培养小鼠PI3K/Akt信号通路激活[43]，因此伏邪及足细胞EMT相关信号因子可作为未来治疗靶点，以期为DN的中西医治疗提供可靠的理论依据。

注：本文出现的英文简写之中文全称对应如下：

P-钙黏蛋白(P-cadherin)

N-钙黏蛋白(N-cadherin)

纤维连接蛋白(fibronectin，FN)

I型胶原(collagen I，Col I)

α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)

基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase3，MMP3)

基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)

转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF

酪蛋白激酶1(casein kinase 1，CK1)