基于UPLC-Q-Orbitrap-MS和网络药理学的覆盆子治疗2型糖尿病作用机制研究

崔琳琳 袁晓梅 高艳红 姜佳峰 关永霞

覆盆子为蔷薇科植物华东覆盆子RubuschingiiHu的干燥果实，含有黄酮类、酚酸类、三萜类、生物碱等多种活性成分，具有降血糖、抗肿瘤等多种药理活性[1]。随着社会技术的发展进步，液质联用技术已广泛应用于中药的有效活性成分鉴定研究中，其具有高选择性、高灵敏度和高精准度等特点，实现了色谱和质谱的优势互补，对未知化合物的鉴定和识别展现出全面、精准的具大优势[2-3]。网络药理学是系统生物信息学研究的重要工具，利用网络可视化方法分析疾病与药物及靶点间复杂的相互作用关系，具有整体性和系统性特点，目前已广泛用于预测中药调控机体生物网络的作用机制研究中[4]。本研究采用超高效液相色谱串联四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Orbitrap-MS)技术对覆盆子中化学成分进行全面快速的鉴定，并结合网络药理学和分子对接技术探索其治疗糖尿病的作用机制，以期为覆盆子的药效物质基础、质量控制及临床应用等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药物

覆盆子(批号：200910)，购于安徽中药饮片有限公司，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为蔷薇科植物华东覆盆子的干燥果实。

1.2 实验试剂

山奈酚3-O-云香糖苷(批号：112007-201602)、鞣花酸(批号：111959-201903)、椴树苷(批号：112000-201802)、槲皮素(批号：100081-201610)、金丝桃苷(批号：111521-201809)、山奈酚(批号：110861-201812)、芦丁(批号：100080-201811)，均购自中国食品药品检定研究院；紫云英苷(批号：ps01137p-0025MG)，购自成都普菲德生物医药科技股份有限公司；乙腈、甲醇、甲酸均为质谱纯，其余为分析纯。

1.3 实验仪器

UPLC-Q-Orbitrap-MS四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Ultimate 3000超高效液相色谱系统(美国Thermo Fisher Scientific公司)，XS105DU型电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，DRHH-S6型数显恒温水浴锅(上海双捷实验设备有限公司)，KS-5200DE型数显恒温超声波清洗机(昆山洁力美超声仪器有限公司)。

1.4 色谱条件

Waters CORTECS C18色谱柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)；流动相：0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)梯度洗脱：0-5分钟，10%～20%B；5-20分钟，20%～30%B；20-50分钟，30%～35%B；50-65分钟，35%～40%B；65-95分钟，40%～50%B；95-100分钟，50%～60%B；流速：0.3 mL/min；进样量1 μL；柱温30℃。

1.5 质谱条件

离子源采用HESI源，雾化电压3.5 kV，鞘气流速：35 μL/min；辅助气流速：10 μL/min；毛细管温度350℃；辅助气加热温度：310℃；扫描模式Full MS/dd-MS2 模式，采用正、负离子模式采集，扫描m/z范围：100～1 500。

1.6 覆盆子活性成分和作用靶点收集

基于液质联用获得的化学成分，通过中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)对成分进行筛选和补充，以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug like，DL)≥0.15为筛选条件，获得活性化合物及其作用的蛋白质靶点，筛选结束后，为标准化蛋白质靶点信息，统一在Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)将化合物作用的蛋白质靶点进行规范。

1.7 2型糖尿病相关靶点收集

以“Type 2 diabetes mellitus”为关键词，应用GeneCards数据库(https://www.genecards.org)、OMIM数据库(http://www.omim.org)、DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca)得到2型糖尿病相关靶点。

1.8 PPI网络的构建

为明晰覆盆子成分相关靶点与2型糖尿病靶点间的相互作用，将二者靶点取交集并绘制韦恩图。进一步将交集靶点提交至STRING11.0数据库(https://string-db.org)构建PPI网络模型，利用Cytoscape3.7.1软件绘制PPI网络图。

1.9 活性成分—疾病靶点生物功能与通路富集分析

将潜在靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，物种选择为“Homo sapiens”，进行基因本体论(Gene ontology，GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，建立数据文件，利用Cytoscape3.7.1软件构建“成分-靶点-通路”网络。

1.10 分子对接验证

对覆盆子核心成分和PPI网络得到的核心靶点进行分子对接验证。从PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)数据库下载核心成分对应小分子配体的2D结构图，通过PyMOL软件将其转化为3D结构，从RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载核心靶点对应的大分子受体蛋白的3D结构，通过PyMOL软件对其移除溶媒和配体分子，并导入AutoDockTools进行加氢等预处理。使用AutoDockTools确定受体蛋白对接区域后，最终运行AutoDockVina1.1.2对受体和配体进行分子对接并计算结合能，利用PyMOL对模型进行可视化。

2 结果

2.1 覆盆子化学成分分析

取覆盆子供试品溶液及混合对照品溶液，按1.4、1.5项下条件进样分析，得到正、负离子质谱图，见图1、图2。使用Xcalibur 3.0软件对质谱信息进行数据分析，结合相关文献报道及对照品进行化合物鉴别[5-9]，鉴定出36种成分，其中黄酮类成分16个，鞣质类成分12个，酚酸类成分8个，见表1。

图2 覆盆子负离子模式下总离子流图

表1 覆盆子主要化学成分表

续表

续表

2.2 活性成分与靶点信息

通过数据库筛选，共筛选覆盆子活性成分8种，潜在靶点155个，获得疾病相关靶点1882个。将覆盆子8种活性成分与155个潜在作用靶点导入Cytoscape3.7.1软件中构建“活性成分-关键靶点”网络图。网络中共涉及163个节点(靶点蛋白)和242条边(蛋白相互作用)，其中倒三角代表活性成分，菱形代表关键靶点。根据网络的拓扑学性质，对网络进行度值评价，筛选重要成分共4种(度值≥17)，有槲皮素、山奈酚、甾谷醇和鞣花酸，推测其是覆盆子治疗2型糖尿病的关键成分。见图3。

图3 覆盆子活性成分-靶点网络图

2.3 PPI网络的构建

将筛选的覆盆子活性成分靶点与疾病靶点取交集，并绘制韦恩图，进而将靶点提交至STRING11.0平台，将STRING11.0数据库中获得的靶点蛋白相互作用数据导入Cytoscape3.7.1软件绘制PPI网络。PPI网络中共有97个节点，776条边。

节点大小和颜色深浅代表度值的大小，节点越大，颜色越深，其对应的度值越大；边的粗细程度代表结合分数，边越粗则结合分数值越大。在该网络中，节点平均度值16，大于平均度值的核心节点共有36个，其中Akt1、IL6、TP53、TNF、VEGFA、MAPK1和JUN靶点蛋白度值较高(>40)，是关键靶点，这提示覆盆子可能通过这些靶点网络发挥作用，同时也提示着各成分之间可能存在的协同作用。见图4、图5。

图4 覆盆子治疗2型糖尿病相关靶点韦恩图

图5 覆盆子治疗2型糖尿病的潜在作用靶点相互作用网络图

2.4 GO富集分析和KEGG通路分析

对覆盆子治疗2型糖尿病的核心靶点进行GO分类和KEGG富集分析，GO功能富集包括生物过程、细胞组分和分子功能3个部分，其中生物过程主要涉及对脂多糖的反应、炎症反应、活性氧代谢过程、上皮细胞增殖等；细胞组分主要涉及膜筏、细胞质核周区、细胞外基质和质膜蛋白复合物等；分子功能主要涉及DNA结合转录因子结合、蛋白质同二聚化活性、细胞因子受体结合和蛋白域特异性结合等。KEGG结果显示主要涉及癌症途径、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路和HIF-1信号通路等，推测覆盆子是通过调节这些通路治疗2型糖尿病的。见图6～9。

图6 覆盆子治疗2型糖尿病的生物过程气泡图

图7 覆盆子治疗2型糖尿病的细胞组分气泡图

图8 覆盆子治疗2型糖尿病的分子功能气泡图

图9 覆盆子治疗2型糖尿病的KGGG通路气泡图

2.5 “成分-靶点-通路”网络的构建

将富集分析得到KEGG通路对应覆盆子治疗2型糖尿病的靶点及成分，构建“成分-靶点-信号通路”网络，此网络由168个节点和694条边构成，其中圆形代表活性成分，菱形代表关键靶点，倒三角代表信号通路。根据网络的拓扑学性质，对网络进行度值评价，根据度值、介度、紧密度确定关键节点。其中度值较高的成分有槲皮素(126)、山奈酚(52)、甾谷醇(29)、鞣花酸(17)。度值较高的通路有Pathways in cancer(60)、TNF信号通路(49)、MAPK信号通路(47)、AGE-RAGE信号通路(37)。

结果显示覆盆子每种活性成分对应多个靶点，每个靶点连接多种成分，体现了“多成分、多靶点”的作用机制，同时，多条通路之间是通过共有靶点连接而非独立分开的，表明各条通路之间可发挥协同作用起到治疗作用。见图10。

图10 覆盆子治疗2型糖尿病的“成分-靶点-通路”网络图

2.6 分子对接

选取PPI网络中度值排名前7的靶点蛋白，即Akt1、IL6、TP53、TNF、VEGFA、MAPK1和JUN与“药物-活性成分-靶点”网络中度值排名前5的活性成分：槲皮素、山奈酚、甾谷醇、鞣花酸和儿茶素。利用AutoDock Tools进行分子对接，结果见表2。对接分数的绝对值越大，化合物与靶点结和力越强，分子构象越稳定，结果显示槲皮素、山奈酚与TP53的亲和力最强，鞣花酸、儿茶素与TNF的结合能力最强，甾谷醇与VEGFA的结合能力最强。其中亲和力较强的分子对接图见图11。可以观察到药物活性成分与靶点蛋白相结合的具体位点，黄色连线为二者之间的氢键相互作用力，是促使分子结合到活性位点的主要作用力。

表2 覆盆子治疗T2DM核心成分与靶点的分子对接结果

图11 覆盆子治疗2型糖尿病核心成分与靶点分子对接图

3 讨论

本研究前期分别对提取溶剂(水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇)以及提取方法(超声、回流)进行了考察，以筛选最佳提取方法。结果表明采用70%甲醇回流提取时，各分析物响应最好，提取率最高，提取效果最优。在优化色谱条件时，本研究重点比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水和乙腈(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸水分别作为流动相时的色谱行为，结果表明采用甲醇-0.1%甲酸水溶液做流动相时的色谱峰较多且分离度较好。

本研究通过液质联用技术鉴定出覆盆子36种成分，其中黄酮类成分16个，鞣质类成分12个，酚酸类成分8个，并通过数据库筛选出槲皮素、山奈酚、甾谷醇和鞣花酸等8个活性成分。研究发现槲皮素通过上调大鼠胰岛细胞瘤细胞活性，促进胰岛素的分泌[10]。此外，槲皮素还可改善高糖引起的细胞损伤，改善糖尿病大鼠的糖代谢水平，保护大鼠胰岛细胞瘤细胞免受高糖损伤。山奈酚可以与α-葡萄糖苷酶直接结合，表现出酶抑制效应，降低体内血糖含量[11]。鞣花酸[12]可显著改善糖尿病小鼠脂肪组织异常的胰岛素信号，降低脂肪组织Beclin1和LC3II/I蛋白表达。

KEGG信号通路富集分析发现覆盆子治疗2型糖尿病的主要信号通路有癌症途径、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路和HIF-1信号通路等。癌症途径主要与癌症疾病相关，与该通路相关的靶基因有61个，这提示2型糖尿病与癌症存在某些共同的靶基因。研究发现，AGEs-RAGE是糖尿病各种并发症发生发展主要原因之一，当机体糖尿病应激状态时，RAGE出现异常高表达，激活下游NF-κB等转录因子高表达，引发炎症反应，使IL-6及TNF-α等炎症因子大量释放，出现组织细胞的功能障碍和结构损伤，引起各种病理变化，从而参与糖尿病多种并发症的发生发展[13-14]。HIF-1信号通路是机体低氧应激反应时的主要靶点,研究表明，抑制HIF-1α表达能降低糖尿病小鼠的血糖水平[15]。TNF-α是一类重要炎性递质，与胰岛素抵抗有密切关系，TNF-α可干扰胰岛素信号的转导通路进而导致机体发生胰岛素抵抗[16-17]。

综上，本研究通过UPLC-Q-Orbitrap-MS技术结合网络药理学方法，对覆盆子的化学成分进行解析并对其治疗2型糖尿病的作用机制进行预测分析，建立了覆盆子“成分-疾病-通路”的生物学网络，并从多个角度探索覆盆子治疗2型糖尿病的潜在分子机制，为覆盆子后续的药效物质基础以及作用机制研究提供了参考。