冠心康冻干粉通过SENP1/STAT3增强小鼠骨髓源巨噬细胞胞葬作用

张一凡 刘萍

冠状动脉粥样硬化是多种心血管疾病的共同病理基础[1]。近些年研究人员逐渐聚焦到胞葬作用及其在动脉粥样硬化中的作用[2]，胞葬作用通过吞噬细胞(如巨噬细胞、上皮细胞)及时清理凋亡细胞，促进炎症消退及胆固醇逆向转运，缩小坏死核面积，增加斑块稳定性[3]。小鼠骨髓源巨噬细胞通常被用来体外基础实验研究，但对其胞葬作用的研究较少。

本课题组结合中医理论和前期的临床研究，以瓜蒌薤白半夏汤为基础方，化裁得到冠心康。冠心康由黄芪、丹参、瓜蒌、薤白、半夏、益母草组成，具有益气化痰活血之效。前期研究发现，冠心康可以促进小鼠腹腔巨噬细胞、脾脏巨噬细胞、RAW264.7细胞的胞葬作用改善动脉粥样硬化[4-6]。因此，本实验旨在观察冠心康冻干粉(以下简称“冠心康”)对小鼠骨髓源巨噬细胞小分子类泛素修饰物特异性蛋白酶1(small ubiquitin-related modifiers /sentri-specific proteases 1，SENP1)/信号传导蛋白和转录激活物(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)分子表达及胞葬作用的影响，进一步探讨冠心康治疗动脉粥样硬化的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性C57BL/6J小鼠6只，6周龄，体质量为18～23 g，购于江苏集萃药康生物科技有限公司。动物生产许可证号：SCXK(苏)2018-0008，动物合格证号：202000150。饲养于上海中医药大学附属龙华医院SPF级动物实验室。动物实验方案经上海中医药大学附属龙华医院伦理委员会批准(实验动物伦理号:2019-N002)。

1.2 试剂与仪器

RIPA裂解液(批号：P0013B)、BCA蛋白定量试剂盒(批号：P0010)、SDS-PAGE电泳试剂(批号：103019200702)、中性红细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(批号：030521210525)，巨噬细胞集落刺激因子(批号：100421211007)，均购自碧云天生物技术有限公司； STAT3、P-STAT3、GAPDH抗体(货号：34、12、7)，购自美国CST公司；TAM酪氨酸激酶受体(TYRO3/AXL/MER receptor tyrosine kinase)、血小板反应蛋白-1(Thrombospondin 1，THBS1)、乳脂球表皮生长因子8(milk fat globule-epidermal growth factor，MFGE8)抗体(批号：GR284192-5、GR220083-6、GR153845-2、GR3304513-1)，均购自英国Abcam公司；SENP1抗体(批号：K0817)，购自美国Santa cruz公司；引物(批号：111359735)由上海闪晶分子生物科技有限公司合成；氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL，批号：H3011720)，购自上海翊圣生物科技有限公司。

高速冷冻离心机(型号5810R，德国 Eppendorf 公司)；StepOne Plus 实时荧光定量PCR仪(型号7500，美国 ABI 公司)；酶标仪(型号SynergyH4，美国BioTek公司)；凝胶成像仪(型号731BR02744)、蛋白电泳仪(型号552BR 225015)，均购自美国BIO-RAD公司；显微镜(型号403497，日本尼康公司)。

1.3 药物及冻干粉制备

冠心康(黄芪30 g、全瓜蒌15 g、薤白12 g、制半夏12 g、益母草30 g、丹参12 g)，由上海中医药大学附属龙华医院中药房提供。将全部草药放入煎药容器煎煮2次；药液放冷后无菌纱布过滤3次，利用旋蒸仪，将中药水煎液浓缩至 1 g/mL，置于-80℃冰箱过夜；次日使用冷冻干燥机制备冠心康冻干粉。DMEM培养基溶解冻干粉，超声混匀过夜，混匀溶液用0.22 μm滤器过滤除菌，配制成50 μg /mL原液，实验时稀释至所需浓度。

1.4 骨髓源巨噬细胞的提取、培养、分组[7]

选取SPF级小鼠，腹腔麻醉后采用脊椎脱臼法处死小鼠，在75%乙醇中浸泡5分钟，用剪刀分离双腿，剔除腿部肌肉组织及其他软组织，暴露出完整的股骨及胫骨；浸入75%乙醇中 5分钟，预冷无菌 PBS 5分钟；在关节处剪断腿骨；用无血清的 DMEM 培养基冲洗腿骨，将骨髓冲洗液加入到离心管中，1 000 r/min离心 5分钟；去上清，加入10 mL 含巨噬细胞集落刺激因子(10 μg/L)和含10%血清的DMEM 培养基重悬，然后分装到细胞培养皿中，置于 37 ℃, 5% CO2的培养箱中培养。

选取上述细胞，用ox-LDL 40 μg/mL诱导6小时，并分别给予含有冠心康冻干粉低、中、高剂量(1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL)的培养基，分为对照组、模型组、冠心康低剂量组、冠心康中剂量组、冠心康高剂量组。提取细胞样本做后续检测，每个实验重复3次。

1.5 免疫荧光检测巨噬细胞纯度

在 24 孔板中，加入浓度为 1×105个/mL的细胞悬液，培养。24小时后，弃上清，4%多聚甲醛固定10分钟，0.1% Triton-X-100通透细胞15分钟。含5% BSA 的0.2% PBST封闭细胞1小时。以一抗F4/80(1∶100)4 ℃ 孵育过夜，二抗(1∶1 000)室温避光孵育 1小时。DAPI染核1分钟，避光。在倒置相差荧光显微镜观察拍照。

1.6 中性红法检测细胞吞噬率

在96孔板中，加入浓度为3×104个/mL 的细胞悬液100 μL，培养24小时；PBS洗3次，分别加入完全培养基、完全培养基+ox-LDL、完全培养基+ox-LDL+低、中、高剂量冠心康，培养24小时；PBS 洗3次，每孔加入20 μL中性红染色液+200 μL培养基，孵育2小时；去除含有中性红染色液的细胞培养液，用PBS洗3次，加入200μL中性红检测裂解液，室温摇床上裂解10分钟。测定540 nm处OD值。

1.7 胞葬相关分子mRNA表达

采用实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)测定AXL、MERTK、TYRO3、THBS1 mRNA表达，按照Trizol法提取总RNA。逆转录合成cDNA选用ABI逆转录试剂盒。在StepOnePlusTM实时荧光定量PCR系统中进行扩增反应。采用2-△△Ct法分析结果，计算目的基因在各组的相对表达量。引物由上海闪晶分子生物科技有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 蛋白免疫印迹法 (Western blotting)检测胞葬相关蛋白表达

加入细胞裂解液提取总蛋白。采用 BCA 法进行蛋白定量。蛋白样品上样至聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，电转至 PVDF膜。封闭1小时后，分别以一抗(1∶1 000)4℃ 孵育过夜，二抗(1∶5 000)室温孵育1小时。电化学法显影后，采集条带并进行灰度分析。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠骨髓源巨噬细胞纯度

免疫荧光检测巨噬细胞的纯度，巨噬细胞特异性标志物 F4/80表达阳性细胞比例达到 99%，表明小鼠骨髓源巨噬细胞培养成功。见图1。

2.2 冠心康对骨髓源巨噬细胞吞噬率的影响

运用中性红法检测细胞吞噬率。与对照组比较，模型组细胞吞噬率降低(P<0.05)；给予不同剂量的冠心康干预后，细胞吞噬率升高(P<0.05)，表明冠心康增强了小鼠骨髓源巨噬细胞的吞噬功能。见表2。

表2 冠心康对骨髓源巨噬细胞吞噬率的影响

2.3 冠心康对骨髓源巨噬细胞胞葬相关分子mRNA表达的影响

运用qRT-PCR法检测各组细胞胞葬相关分子mRNA表达。与对照组比较，模型组细胞AXL、MERTK、TYRO3、THBS1的mRNA表达降低(P<0.05)；给予不同剂量的冠心康干预后，冠心康高剂量组AXL的mRNA表达升高(P<0.05)，冠心康中剂量组TYRO3的mRNA表达升高(P<0.05)，冠心康中、高剂量组MERTK、THBS1的mRNA表达升高(P<0.05)，表明冠心康促进小鼠骨髓源巨噬细胞胞葬相关分子mRNA表达。见表3。

表3 冠心康对骨髓源巨噬细胞胞葬相关分子mRNA表达的影响

2.4 冠心康对骨髓源巨噬细胞胞葬相关分子蛋白表达的影响

运用Western Blotting法检测各组细胞胞葬相关分子蛋白表达。与对照组比较，模型组细胞AXL、MERTK、TYRO3、THBS1、MFGE8 蛋白表达降低(P<0.05)；给予冠心康干预后，冠心康低、中、高剂量组AXL、MERTK、TYRO3蛋白表达升高(P<0.05)，冠心康中、高剂量组THBS1、MFGE8y蛋白表达升高(P<0.05)，表明冠心康促进小鼠骨髓源巨噬细胞胞葬相关分子蛋白表达。见图2、表4。

注：A 对照组；B 模型组；C 冠心康低剂量组；D 冠心康中剂量组；E 冠心康高剂量组

表4 冠心康对骨髓源巨噬细胞胞葬相关分子蛋白表达的影响

2.5 冠心康对骨髓源巨噬细胞SENP1/p-STAT3分子蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组细胞SENP1、p-STAT3蛋白表达降低(P<0.05)；给予冠心康干预后，冠心康低、中、高剂量组SENP1蛋白表达升高(P<0.05)，冠心康中、高剂量组 p-STAT3蛋白表达升高(P<0.05)，表明冠心康促进SENP1/p-STAT3分子表达。见图3、表5。

注：A 对照组;B 模型组;C 冠心康低剂量组;D 冠心康中剂量组;E 冠心康高剂量组

表5 冠心康对骨髓源巨噬细胞SENP1/p-STAT3蛋白表达的影响

3 讨论

冠状动脉粥样硬化属于中医学“胸痹心痛”“脉痹”等范畴。叶天士《临证指南医案》曰：“痹者……皆由气血亏损，腠理疏豁，风寒湿三气得以乘虚外袭，留滞于内以致湿痰、浊血流注凝涩而得之。”本证为本虚标实之证，脾肾两虚，气虚导致痰浊、血瘀内生，痰瘀互结，痹阻脉络，发为痹症[8]。因此在治疗上需要健脾益气、化痰祛瘀的治法[9]。本课题组结合动脉粥样硬化气虚痰瘀的中医病机和前期的临床研究，以瓜蒌薤白半夏汤为基础方临证化裁为黄芪、丹参、瓜蒌、薤白、半夏、益母草，组成冠心康。全方以黄芪为君药，补气虚治本，其主要活性成分黄芪多糖能提高巨噬细胞吞噬活性[10]；瓜蒌、丹参为臣药，化痰活血，其中丹参多种活性成分如丹酚酸B、丹参酮IIA，对胞葬作用均有调控作用[11]；薤白、半夏、益母草为佐药，助臣药化痰活血之力。全方具有益气活血、化痰降浊之效。课题组前期研究发现[4-6]，冠心康有效改善小鼠动脉粥样硬化，上调THBS1和TAM受体蛋白，促进胞葬作用，但冠心康调控胞葬作用的机制尚不完善。

有效的胞葬作用能防止凋亡细胞发生继发性坏死以及释放炎性因子，减缓动脉粥样硬化进展[12]。胞葬作用的有效完成需要多种分子协同配合，如“寻我”信号分子、“食我”信号分子、桥接分子等。TAM酪氨酸激酶受体家族作为 “食我”受体，包括TYRO3、AXL和MERTK。当MERTK缺失会加重小鼠炎症，促进动脉粥样硬化进展[13]；TYRO3和MERTK的变异与颈动脉粥样硬化斑块的发生关系密切[14]。THBS1、MFGE8均是桥接分子，负责结合凋亡细胞“食我”信号分子与巨噬细胞的吞噬受体。研究发现，骨髓源性细胞中缺乏MFGE8会增加斑块中凋亡细胞的积累[15]。在晚期动脉粥样硬化小鼠模型中，MFGE8、MERTK等多种胞葬相关分子发挥重要作用清除斑块中凋亡细胞[16]。

SENP1是一种半胱氨酸特异的蛋白酶，是SENP家族酶活性较强且最为经典的成员，可以调控血管生成、氧化应激、炎症反应等[17]。研究发现，SENP1+/-小鼠冠状动脉粥样硬化斑块面积显著增大[18]。STAT3是信号传导活化转录因子家族的重要成员，调控细胞增殖、凋亡、血管生成、炎症反应等[19]。研究发现，SENP1可以上调STAT3的磷酸化和转录活性，活化的STAT3可以提高巨噬细胞的胞葬作用[20-21]。

本研究结果显示，与对照组比较，模型组细胞吞噬率、胞葬相关分子、SENP1、p-STAT3表达量降低；与模型组比较，冠心康干预后，细胞吞噬率、胞葬相关分子、SENP1、p-STAT3表达量升高。综上所述，冠心康通过上调SENP1的表达，促进STAT3的磷酸化，从而增强骨髓源巨噬细胞的胞葬作用，但相关机制有待进一步研究。本研究为SENP1、STAT3与巨噬细胞胞葬作用的关系提供了一定的实验依据。