纳布啡调控Wnt/β-catenin信号通路抑制瑞芬太尼诱导的痛觉过敏

任 聪 刘海萍

1 佳木斯大学，黑龙江省佳木斯市 154000； 2 佳木斯大学附属第一医院麻醉科

瑞芬太尼是一种临床常用麻醉药，具有起效快、镇痛作用强及易苏醒等特点，但临床研究显示长时间或大剂量使用容易诱发痛觉过敏[1-2]。因此防治瑞芬太尼诱导的痛觉过敏已成为目前的研究热点。而纳布啡是一种新型的受体激动剂及μ型阿片拮抗剂，常用于各类病理性疼痛的治疗和超前辅助麻醉[3-4]。由于瑞芬太尼是一种μ型阿片受体激动剂，因此纳布啡对瑞芬太尼诱导的痛觉过敏具有一定抑制作用[5]，但其分子层面的机制目前尚不明确。Wnt/β-catenin信号通路已被证实在痛觉过敏的发生、发展中发挥重要作用[6]，也是治疗痛觉过敏的潜在治疗靶点，但其是否是纳布啡抑制瑞芬太尼诱导的痛觉过敏机制尚未证实。本研究拟采用纳布啡预处理切口痛大鼠模型，探讨其对瑞芬太尼诱导的痛觉过敏的作用机制是否与Wnt/β-catenin通路有关。

1 材料与方法

1.1 材料 32只SPF级成年雄性SD大鼠，体重(200±30)g，由哈尔滨医科大学实验动物部提供，许可证号：SYXK(黑)-2019-0001。注射用盐酸瑞芬太尼和盐酸纳布啡(宜昌人福药业有限责任公司)；N-甲基-D-天冬氨酸受体1(N-methyl D-aspartate receptor subunit1，NR1)、NR2A、NR2B、Wnt3a和β-catenin兔抗大鼠多克隆一抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 切口痛模型制备：大鼠经七氟醚(3.5%诱导，3%保持)吸入麻醉后，右后足底碘伏消毒后参照Brennan[7]的方法制备切口痛模型：从近端0.5cm处向趾端行长约1cm的切口，切开皮肤和筋膜后，挑起足底肌肉并纵向切割，保持其起止附着点的完整。纱布按压止血后，用5-0尼龙丝线缝合皮肤，切口覆盖金霉素软膏抗感染。

1.2.2 动物分组及处理：将大鼠随机分为对照组(S组)、切口痛模型组(I组)、瑞芬太尼+切口痛模型组(R+I组)和纳布啡+瑞芬太尼+切口痛模型组(N+R+I组)，每组8只。其中R+I组和N+R+I组在造模前静脉输注瑞芬太尼1.0μg/ (kg·min)，S组和I组输注同体积生理盐水。输注5min后对I组、R+I组及N+R+I组建立切口痛模型；而S组只进行七氟醚麻醉和右后足底碘伏消毒及覆盖金霉素，但不行切口手术。N+R+I组在瑞芬太尼输注前3min 静脉注射纳布啡0.6mg/kg，其他组注射同体积的生理盐水。

1.2.3 痛觉行为学的检测：分别于造模前24h(T0)和造模后2h、6h、24h、48h(T1～4)进行痛觉行为学测定。采用PL-200热刺痛仪(成都泰盟科技有限公司)测定热刺激缩爪反应潜伏期(Paw withdrawal latency，PWL)，间隔10min测量3次取平均值。使用von Frey电子测痛仪(ALMEMO 2390-5，AHLBORN)检测机械刺激缩爪反应阈值(Paw withdrawal threshold，PWT)，间隔10min测量3次取平均值。

1.2.4 ELISA检测炎性因子水平: 最后1次行为学检测后，在麻醉状态下颈椎脱臼处死大鼠，迅速取左侧L4～6脊髓背角组织，保存于-80℃批量检测。取脊髓组织制成匀浆液，按ELISA试剂盒说明检测组织中TNF-α和IL-1β的水平，同时BCA法检测组织中蛋白浓度，以计算每克蛋白中所含因子含量。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达水平：取组织标本加入一定比例的蛋白裂解液，研磨成匀浆后4℃离心10min 取上清液，并采用BCA法检测蛋白浓度。然后进行SDS-PAGE电泳、转膜及封闭，加入兔抗大鼠一抗(NR1、NR2A、NR2B、Wnt3a、β-catenin及β-actin)，4℃孵育过夜，然后加入羊抗兔二抗，室温孵育1h，化学发光显影后采用Image J 计算目的条带与内参条带灰度值的比值(以β-actin为内参)，即目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠各时间点痛觉行为学指标比较 各组大鼠T0时PWL和PWT值无统计学差异(P>0.05)；与S组比较，I组、R+I组和N+R+I组T1～T4时PWL和PWT值均明显降低(P<0.05)；与I组比较，R+I组T1～T4 时PWL和PWT值均明显降低(P<0.05)；与R+I组比较，N+R+I组T2～T4时PWL值和PWT值均明显升高(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠不同时间点PWL值及PWT值比较

2.2 纳布啡对脊髓组织炎性因子的影响 与S组比较，I组、R+I组和N+R+I组TNF-α和IL-1β水平均明显升高(P<0.05)；与I组比较，R+I组TNF-α和IL-1β水平均明显升高(P<0.05)；与R+I比较，N+R+I组TNF-α和IL-1β水平均明显降低(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠脊髓组织TNF-α和IL-1β水平比较

2.3 纳布啡对脊髓组织NMDA受体蛋白表达的影响 与S组比较，I组、R+I组和N+R+I组NR1和NR2B蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)；与I组比较，R+I组NR1和NR2B蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)；与R+I比较，N+R+I组NR1和NR2B蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)，见图1。

图1 各组大鼠NMDA受体蛋白表达水平比较

2.4 纳布啡对Wnt/β-catenin通路的影响 与S组比较，I组、R+I组和N+R+I组Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)；与I组比较，R+I组Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)；与R+I比较，N+R+I组Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)，见图2。

图2 各组大鼠Wnt/β-catenin通路蛋白表达水平比较

3 讨论

瑞芬太尼是选择性μ型阿片受体激动剂，有呼吸抑制作用弱、镇痛效应强、血流动力学平稳及半衰期短等优点，在临床麻醉中已得到广泛应用，但诱发痛觉过敏率较高[8]。痛觉过敏不仅导致全麻苏醒期躁动，也能降低术后阿片类药物的镇痛效果甚至影响预后，目前尚未发现有效防治措施[9]，因此有效预防、治疗瑞芬太尼诱导的痛觉过敏反应已成为目前研究的热点。纳布啡是一种新型混合型阿片受体激动—拮抗镇痛药，不仅可用于术前镇痛，也已广泛用于各种病理性疼痛的治疗[10-11]。邢娜等[12]研究发现静脉预注射纳布啡可有效缓解内镜下食管静脉曲张套扎治疗患者的术后疼痛，且不良反应发生率显著降低。此外，多项临床及基础研究也显示纳布啡可有效预防瑞芬太尼诱发的术后痛觉过敏，并可辅助增强镇静效果，避免麻醉恢复期出现躁动，减少不良反应，提高患者疼痛耐受性[13-14]。本研究结果显示，与对照组相比，瑞芬太尼诱导的切口痛模型大鼠术后PWL和PWT值均显著降低，提示大鼠痛觉阈值降低即诱发了痛觉过敏；而纳布啡预处理大鼠术后6～48h的PWL和PWT值均明显高于未行纳布啡处理大鼠，提示纳布啡对瑞芬太尼诱导的痛觉过敏有一定抑制作用，与现有研究结果一致[15]。

已有证据显示神经炎症和N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体的激活也是痛觉过敏发生的必经机制之一。有证据显示长期大剂量使用瑞芬太尼后突然撤离，会对μ受体效应形成抑制，并释放大量兴奋性氨基酸、诱导NMDA受体活化，对炎性因子的分泌起到促进作用，增加神经细胞的敏感性，导致患者术后出现痛觉过敏[5,16]。同时有证据显示抑制NMDA受体活性、降低炎症因子水平，也是改善痛觉过敏的主要手段[17-18]。本研究结果显示，纳布啡预处理痛觉过敏大鼠的脊髓组织TNF-α、IL-1β水平及NR1、NR2B蛋白含量明显低于痛觉过敏大鼠，提示纳布啡可能通过抑制NMDA受体活化，降低促炎性细胞因子水平，从而抑制痛觉过敏的发生。

Wnt/β-catenin信号通路是经典Wnt信号通路，它参与调节神经系统的发育，同时也参与维持成年哺乳动物神经系统的结构和功能[19]。目前研究发现Wnt/β-catenin通路是介导神经病理性疼痛发生和维持的关键靶点[20-21]。瑞芬太尼引起的痛觉过敏机制与神经病理性疼痛类似，有证据显示Wnt/β-catenin信号通路的激活对瑞芬太尼痛觉过敏具有促进作用，抑制Wnt/β-catenin信号通路可以有效预防痛觉过敏[6,22]。本研究结果显示，纳布啡预处理的切口痛模型大鼠Wnt3和β-catenin水平明显低于未进行纳布啡处理的大鼠，提示纳布啡可能抑制了Wnt3/β-catenin信号通路的激活，从而抑制痛觉过敏的发生。以往研究发现Wnt通路的激活可以刺激IL-1β和TNF-α等炎症因子的产生，调节NMDA受体NR2B亚基的活性，调节β-catenin旁路中的钙离子依赖信号；而Wnt抑制剂能抑制小胶质细胞β-catenin的表达，减少脊髓背角细胞NR2R亚基的磷酸化[17,23]。因此推测纳布啡抑制瑞芬太尼诱导的痛觉过敏，可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，降低NMDA受体NR2B亚基的活性及炎症反应进行的。

综上所述，纳布啡可以预防痛觉过敏的发生，其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的抑制，以及进一步的神经炎症、NMDA受体激活抑制有关。