一株维氏气单胞菌发酵培养基优化及其制备疫苗免疫效力比较

孙承文，江小燕,赖迎迢,2，赵长臣，刘春花，任 燕,2， 巩 华,2，陈总会，陶家发,2*

(1.中国水产科学研究院 珠江水产研究所，广东 广州 510380；2.农业部渔药创制重点实验室 广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东 广州 510380)

维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)隶属于弧菌科气单胞菌属，可引起人、兽及多种水生生物发病，如人体感染可导致胃肠炎、腹膜炎、败血症和外伤感染等疾病[1-3]，可感染鱼、虾、龟等多种水生动物[4-10]，引起多种淡水鱼肠炎、腹水及出血等症状发生，造成养殖鱼类大规模发病死亡，给养殖户带来巨大的经济损失。长期以来，抗生素治疗是针对水产养殖过程细菌性疾病的主要治疗方法，但此方法极易使致病菌产生耐药性特别是多重耐药性[11-12]，且水产动物体内的药物残留也危及环境及食品安全。目前水产养殖业许多学者对多种鱼类进行维氏气单胞菌疫苗免疫研究，已取得了很好的预防效果[13-16]。因此推进维氏气单胞菌疫苗的商品化、产业化进程，对于水产养殖业的健康发展和水产品安全具有十分重要的意义。然而关于该菌不同培养基组成对其发酵工艺及制备灭活疫苗的免疫效力影响的研究鲜见报道。本研究通过测定发酵菌液活菌数，采用响应面法设计优化维氏气单胞菌灭活疫苗发酵培养基组成及用量，研究培养基碳源、氮源、硫酸盐、磷酸盐及其交互作用对发酵菌液活菌数的影响，并比较考察优化培养基与基础培养基制备的灭活疫苗免疫效力，为建立更高产稳定的疫苗发酵工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)CA07，由中国水产科学研究院珠江水产研究所分离自患细菌性败血病鲫鱼肾脏并鉴定、保藏。

1.1.2 培养基 ①基础培养基(营养肉汤培养基NB)：蛋白胨 10.0 g/L，牛肉膏 3.0 g/L，氯化钠 5.0 g/L。②营养琼脂固体培养基：基础培养基+18.0 g/L琼脂。

1.1.3 主要仪器与设备 恒温摇床(ZWY-211B，上海智诚分析仪器制造有限公司)；自动发酵罐(Cell-BF-7 L，中国齐志生物工程设备有限公司)；紫外分光光度计(UV1800PC，上海奥析科学仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 一级种子液制备 将维氏气单胞菌CA07菌种用营养肉汤培养基溶解后，划线接种于营养琼脂固体培养基，28 ℃培养 24 h，挑取典型菌落接种于含营养肉汤液体培养基，28 ℃，150 r/min震荡培养 14～16 h，作为一级种子液。

1.2.2 单因素试验 以营养肉汤为基础培养基，进行单因素试验，其他条件保持不变，比较氮源(细菌学蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏)、碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉)、磷酸盐(磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾)、硫酸盐(硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸锌)对维氏气单胞菌CA07生长影响，确定最佳氮源、碳源、磷酸盐、硫酸盐因子，以及最佳添加量对活菌数的影响。

1.2.3 响应面试验对发酵培养基的优化 结合单因素试验结果，利用响应面Box-Behnken试验，设计3因素3水平响应面试验方案。

1.2.4 优化后发酵培养基验证试验及灭活疫苗制备 分别用优化后的培养基组分配制的发酵培养基和基础培养基摇瓶发酵培养维氏气单胞菌CA07，培养结束后测定维氏气单胞菌CA07的活菌数，比较优化培养基、基础培养基对活菌数的影响。分别添加甲醛溶液(添加后甲醛溶液终浓度为0.30%)于优化培养基、基础培养基发酵的菌液中，37 ℃灭活24 h，制备灭活疫苗后稀释备用。

1.2.5 不同培养基制备的灭活疫苗免疫效力比较 将制备的灭活疫苗按活菌数以生理盐水调整至灭活前活菌数约4.0×109cfu/mL。取健康鲫鱼(体质量12～16 g)90 尾，先在27～29 ℃的水环境下饲养7 d以上，确认健活后，将鱼随机分为3 组，每组30 尾。免疫组腹腔分别注射灭活菌液0.2 mL/尾，对照组腹腔注射生理盐水0.2 mL/尾。免疫28 d后，免疫组和对照组腹腔各注射维氏气单胞菌CA07菌液进行攻毒，攻毒后观察7 d，每日记录各组的死鱼数，比较不同发酵培养基制备的CA07株灭活疫苗免疫效力。按公式计算疫苗的相对免疫保护率(RPS)：RPS(%)=(1-(免疫组死亡率/对照组死亡率))× 100%

1.2.6 7 L发酵罐发酵试验 配制5 L 优化后的培养基于 7 L 发酵罐中高压灭菌，待冷却至 28 ℃ 时，接种5%(体积分数)维氏气单胞菌CA07菌液于优化后的液体培养基中，发酵罐培养温度为28 ℃，转速为200 r/min，通气量为4 L/min，每隔2 h 取样测定OD600值，绘制该菌的生长曲线及检测活菌数。

1.2.7 数据处理 单因素试验数据采用Excel 2010软件进行统计和差异显著性分析，响应面试验数据采用 Design Expert 12.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 碳、氮源对维氏气单胞菌CA07生长的影响

以葡萄糖作为培养基碳源时，活菌数最高为3.30×109cfu/mL，且显著高于其他碳源组，其次为蔗糖、麦芽糖，以可溶性淀粉为碳源时，菌液活菌数最低(图1)。因此，选择葡萄糖作为培养基最佳碳源。

图1 碳源种类对活菌数的影响Fig.1 Effect of carbon source types oncounts of viable bacteria

以胰蛋白胨为氮源时，维氏气单胞菌CA07的活菌数最高为4.20×109cfu/mL，且显著高于其他氮源组，以大豆蛋白胨作为单一氮源时，维氏气单胞菌CA07的活菌数次之，而以细菌学蛋白胨、酵母膏做为氮源时，维氏气单胞菌CA07活菌数最低(图2)。说明胰蛋白胨作为维氏气单胞菌CA07培养基氮源效果更好。因此，选择胰蛋白胨作为维氏气单胞菌CA07培养基氮源。

图2 氮源种类对活菌数的影响Fig.2 Effect of nitrogen source types on counts of viable bacteria

从图3可以看出，碳氮比对维氏气单胞菌CA07活菌数影响很大，碳源比例高活菌数低，随着氮源比例升高，活菌数也逐渐增加，当碳氮比为C∶N=1∶2时，活菌数最高，为4.57×109cfu/mL，说明氮源的用量在较高浓度区域时，有利于细菌发酵活菌数的增加。

图3 不同碳氮比对活菌数的影响Fig.3 Effect of carbon source nitrogen source ratio addition on counts of viable bacteria

2.2 磷酸盐对维氏气单胞菌CA07生长的影响

从图4可见，培养基中添加等量的磷酸二氢钾作为培养基磷源时，维氏气单胞菌CA07活菌数为4.43×109cfu/mL，最高且显著高于其他组(P<0.05 )，其次为磷酸氢二钠。因此，选择磷酸二氢钾作为培养基磷源。磷酸二氢钾的添加量在1.5 g/L时，维氏气单胞菌CA07活菌数最高(图5)。

图4 磷酸盐种类对活菌数的影响Fig.4 Effect of phosphate types on counts of viable bacteria

图5 磷酸二氢钾添加量对活菌数的影响Fig.5 Effect of KH2PO4 on counts of viable bacteria

2.3 硫酸盐对维氏气单胞菌CA07生长的影响

从图6可见，在培养基中添加等量的硫酸盐条件下，添加硫酸镁时，维氏气单胞菌CA07菌液活菌数最高为4.59×109cfu/mL，且显著高于其他组 (P<0.05)，其次为硫酸亚铁，最低为硫酸锰。因此，选择硫酸镁作为培养基无机盐。硫酸镁为0.40 g/L时，维氏气单胞菌CA07的活菌数最高(图7)。

图6 硫酸盐种类对活菌数的影响Fig.6 Effect of sulfate types on counts of viable bacteria

图7 硫酸镁添加量对活菌数的影响Fig.7 Effect of MgSO4 on counts of viable bacteria

2.4 响应面优化试验

2.4.1 响应面优化试验设计及结果 根据单因素试验的结果，选取碳氮比(A)、硫酸镁(B)和磷酸二氢钾(C)3个因素进行响应面优化设计(表1)，以活菌数(Y)为响应值，维氏气单胞菌活菌数结果见表2。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

表2 Box-Behnken 试验设计及结果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

表3 响应面模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface model

2.4.3 响应面图分析 各因素交互作用对菌株发酵活菌数结果的影响见图8。当3个因素其中之一固定为零水平时，其他两个因素存在交互作用且存在一个活菌数最大值的组合点。在3组交互影响的图中，可以看出当其中一个因素固定时，随着另一因素的增大，维氏气单胞菌活菌数呈现先增大后减小的趋势。

图8 各因素交互作用对活菌数影响的响应面和等高线Fig.8 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on counts of viable bacteria

由图8可以看出，当硫酸镁用量固定时，活菌数随碳氮比及磷酸二氢钾用量的变化幅度较大，而活菌数随着硫酸镁用量的变化幅度较小，氮碳比、磷酸二氢钾对发酵维氏气单胞菌CA07的影响较为显著。通过最优化分析，确定最适发酵培养基配方组成及用量：胰蛋白胨10.8 g/L，葡萄糖5.0 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，硫酸镁0.4 g/L。

2.5 发酵活菌数比较试验

通过对优化后培养基与基础培养基在发酵维氏气单胞菌活菌数的比较，优化培养基培养维氏气单胞菌活菌数为5.94×109cfu/mL，基础培养基培养维氏气单胞菌活菌数为4.15×109cfu/mL，活菌数增加了43.13%，效果显著(图9)。

图9 维氏气单胞菌两种培养基的比较Fig.9 Comparison among the two culture mediums of Aeromonas veronii

2.6 免疫效力比较试验

免疫效力比较结果见表4，以优化培养基制备的灭活疫苗相对免疫保护率为77.78%，以基础培养基制备的灭活疫苗相对免疫保护率为62.97%以上，以优化培养基制备的灭活疫苗相对免疫保护率提高了14.81%。通过优化发酵培养基组成在获得更高的活菌数同时，能显著提高该疫苗的相对免疫保护率。

表4 不同发酵培养基菌液制备的疫苗免疫效力比较Table 4 Comparison of immune efficacy of vaccines prepared by different fermentation mediums

2.7 7 L发酵罐发酵生长试验

根据响应面试验优化结果，配制含蛋白胨10.8 g/L、牛肉膏3.0 g/L、葡萄糖5.0 g/L、硫酸镁0.40 g/L、磷酸二氢钾2.0 g/L、氯化钠5.0 g/L的发酵培养基，28 ℃，300 r/min培养12 h，维氏气单胞菌生长曲线见图10。结果显示，维氏气单胞菌CA07培养10～12 h进入生长高峰期，发酵10 h达到生长高峰，活菌数达到8.85×109cfu/mL，发酵12 h后进入衰亡期。

图10 维氏气单胞菌发酵生长曲线Fig.10 Growth curve of Aeromonas veronii during the fermentation

3 讨 论

本研究以发酵维氏气单胞菌菌液活菌数为目标，通过单因素试验及响应面试验进行设计优化，对碳氮比、硫酸镁、磷酸二氢钾三个因素进行响应面分析，结果显示模型显著，失拟不显著，说明这个因素对维氏气单胞菌菌液活菌数有显著影响。建立了一个维氏气单胞菌活菌数产量与三个因素的数学模型，此模型能很好地拟合实验结果，其预测条件与验证实验基本吻合。得到维氏气单胞菌的最优发酵培养基为胰蛋白胨10.8 g/L，葡萄糖5.0 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，硫酸镁0.4 g/L，发酵活菌数为5.94×109cfu/mL，基础培养基培养维氏气单胞菌活菌数为4.15×109cfu/mL，活菌数增加了43.13%。在此发酵培养基条件下维氏气单胞菌在7 L发酵罐活菌数达到8.85×109cfu/mL。相较于BHI、TSB等商品化培养基，优化后的发酵培养基能显著降低生产成本。

通常对细菌发酵培养基优化多采用单因素法、正交试验法、响应面法。单因素试验实验设计简单，但忽略了因素之间的交互作用；正交设计无法确定试验影响因素的最佳组合和试验结果响应值的最大值；响应面优化法对整个面进行全面分析，研究因素与响应值之间，因素与因素之间的关系，并进行优化，得到的数据更精确、更全面，对试验有显著影响的因素都可以应用响应面优化法进行优化[14]。较多的研究采用响应面法对芽胞杆菌、乳酸杆菌等发酵培养基组分、用量进行优化，得到最优发酵培养[15-17]。本研究使用的响应面法即可考察因素之间的交互作用，又可寻找到整个区域内的最优解，进一步降低了培养基用量，从而降低成本。通过单因素试验确定了主要培养基种类及最佳适用量范围后，再通过响应面分析充分考虑活菌数与用量之间的交互作用，并通过相应曲面寻找最优解。

细菌疫苗免疫效力的提升方法常见的包括改造菌株抗原制备亚单位疫苗、活疫苗、DNA疫苗等，或者通过与佐剂等提呈作用以达到提高免疫效力的目的，具有较好的效果，然而这些方法较为复杂、成本相对较高。本研究通过对细菌发酵培养基组成、用量的优化最终获得低成本、高效的疫苗目标。优化培养基发酵菌液制备的灭活疫苗免疫鲫鱼的相对免疫保护率为77.78%，相对免疫保护率比基础培养基提高了14.81%，表明优化培养基发酵菌液制备的灭活疫苗具有良好的免疫保护效果。