恩诺沙星在马口鱼体内的代谢动力学

何欣， 柳爱春， 白俊慧， 童朝明

(杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024)

马口鱼(Opsariichthysbidens)属鲤形目、鲤科、马口鱼属，别名桃花鱼[1]。和其他常见的养殖鱼类品种相比，马口鱼鱼肉味道鲜美、营养丰富，特别是脂肪中人体必需脂肪酸含量丰富，如DHA含量达20.72%，EPA含量达7.34%[2]，深受消费者的喜爱。因其生长较快、病害较少、繁殖力较强、人工养殖条件下喂食配合饲料生长良好，目前马口鱼养殖产业已形成一定的规模，主要的养殖方式为水库网箱养殖、池塘养殖、池塘循环流水养殖等[3-4]。

随着养殖规模不断扩大，集约化程度不断提高，马口鱼的病害问题已逐渐成为影响整个马口鱼养殖发展的重要因素。根据现有报道，马口鱼养殖中目前主要的疾病是各类寄生虫病，如鱼怪(Ichthyoxenusjaponensis)、扇棘单睾吸虫(HaplorchistaichuiKatsuta)等[5-6]，而细菌性疾病较少，所以目前国内外对使用抗生素治疗马口鱼细菌性疾病的研究报道较少，因此，有必要开展抗生素在马口鱼体内的代谢研究。

恩诺沙星是一种广谱、高效、低毒的抗菌药物，其直接作用于细菌的核质体，抑制细菌的DNA旋转酶,使酶不能在DNA双链上引入切口，破坏细菌的代谢和增殖[7]。根据《动物性食品中兽药最高残留限量》(农业部公告第235号)中的规定，恩诺沙星可用于牛、羊、猪、兔、家禽等各类食用养殖动物，其中在水产动物中肌肉和脂肪中的最高残留限量为100 ng·kg-1，肝脏和肾脏中的最高残留限量为200 ng·kg-1。

本研究采用口服连续给药的方式，研究马口鱼血浆、肌肉和肝脏中恩诺沙星的代谢动力学规律，为恩诺沙星在马口鱼养殖中的合理用药方法及休药期提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物与主要试剂

盐酸恩诺沙星可溶性粉，浓度≥98%，国邦公司；恩诺沙星标准品，浓度≥99%，德国Dr.E公司；恩诺沙星内标氘代恩诺沙星，德国Dr.E公司；超纯水采用MILL-Q超纯水仪制备，用水符合GB/T 6682—2008一级水的标准；甲醇，色谱纯，Thermo公司；乙腈，色谱纯，Thermo公司；甲酸，色谱纯，Thermo公司。无水硫酸钠，分析纯，经高温灼烧4 h后，置于密闭容器中备用；肝素钠，上海哈灵生物科技有限公司。

1.2 主要仪器

高效液相色谱仪串联质谱仪Waters Acquity UPLC，并配有电喷雾离子源(ESI)，Waters公司；旋转蒸发器；涡旋混合器，IKA MS 3 digital；超声仪，Ultrasonic cleaner；离心机，5 000 r·min-1，Fulgor TDL-5A；氮吹仪，OA-SYS N-EVAP 112；均质机；分液漏斗；微孔滤膜；玻璃离心管，10 mL；塑料离心管，50 mL。

1.3 试验动物的选择

健康马口鱼，400尾。体重为(45±15)g，采自浙江省水产技术推广总站外塘(30 m×60 m)，体态正常，无明显外伤。经随机抽取检测，马口鱼体内未检出恩诺沙星。试验前在杭州市农业科学研究院室内水循环养殖水池中驯养14 d，水池高1 m，半径0.6 m，水温(22±2)℃。驯养期间投喂不含恩诺沙星的普通饲料。

1.4 给药方式与剂量

将3.31 g盐酸恩诺沙星用水溶解后，添加6 g饲料黏合剂与15 kg饲料拌匀后阴暗处晾干。连续投喂给药5 d，每天的投喂量为鱼体重的5%，相当于每尾马口鱼每天10 mg·kg-1的恩诺沙星的剂量。

1.5 样品采集与保存

采样时间点分别为给药后1、2、4、8、12、24、48、72、120、168、240、360和720 h，每个时间点随机采集24尾马口鱼，将24尾随机分为3组，每组8尾，尾椎取血至少2 mL至肝素钠处理过后的塑料离心管中，分离血浆。去鳞、去皮，沿脊背取肌肉，置于研磨机中研磨均匀。取肝脏样品置于研磨机中研磨均匀。样品于-20 ℃冰箱保存，待测。

1.6 组织中恩诺沙星浓度测定方法

1.6.1 前处理方法

前处理方法参照《农业部1077号公告-1-2008，水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留的测定 液相色谱-串联质谱法》，并作适当修改。准确称取(5.00±0.01)g的样品于50 mL聚丙烯离心管中，加入50 μL 1 000 ng·mL-1的氘代恩诺沙星内标工作液，涡旋30 s，避光静置10 min，加入10 g无水硫酸钠，涡旋混匀后加入20 mL酸化乙腈，超声提取15 min，4 000 r·min-1离心10 min后取上清液于50 mL比色管中，残渣加入20 mL酸化乙腈重复提取一次，合并提取液用乙腈定容至50 mL，准确量取10.0 mL，40 ℃氮气吹干。

残渣加入1.0 mL甲醇溶解，再加入2.0 mL正己烷净化，取甲醇层于2 mL离心管中以13 000 r·min-1离心5 min，过0.2 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.6.2 色质谱条件

流速为0.4 mL·min-1；色谱柱为Waters BEH C18，2.1 mm×100 mm(1.7 μm)；柱温为35.0 ℃，进样量2 μL；离子源及扫描方式为ESI+；检测方式为MRM；电喷雾电压为3.0 kV；脱溶剂温度为500 ℃；碰撞气为0.16 mL·min-1。

1.7 数据处理

采用3p97药动学软件处理数据，选取最适合的房室模型，计算药动学参数。

2 结果与分析

2.1 方法学验证

2.1.1 恩诺沙星的色谱图

按照1.6节色质谱条件，恩诺沙星保留时间为6.61 min左右，阳性样品色质谱如图1所示。

图1 阳性样品的恩诺沙星色谱

2.1.2 标准工作曲线与定量限

移取恩诺沙星标准溶液并稀释成质量浓度分别为20.00、50.00、100.00、150.00和200.00 ng·mL-1的恩诺沙星标准溶液，同样加入恩诺沙星内标配置标准曲线，按仪器工作条件进行测定。恩诺沙星浓度为20.00～200.00 ng·mL-1，浓度与峰面积的线性关系良好，定量限(LOQ，S/N>10)为20.00 ng·mL-1。标准工作曲线如图2所示。

图2 恩诺沙星的标准工作曲线

2.1.3 加标回收率

向空白血浆、肌肉和肝脏中加入恩诺沙星标准品。马口鱼各组织中加标不同浓度恩诺沙星的平均回收率如表1所示，相对标准偏差(RSD)均小于10%，符合检测要求。

表1 马口鱼各组织中加标不同浓度恩诺沙星的回收率

2.2 恩诺沙星的药代动力学特征

2.2.1 药时曲线

经过测定，每个时间点马口鱼血浆、肌肉、肝脏中恩诺沙星的浓度如表2所示。

表2 给药后不同时间马口鱼各组织中恩诺沙星的浓度

2.2.2 药动学参数及药动学方程

经过3P97药动学数据处理软件的分析，投喂恩诺沙星后马口鱼体内的血浆、肌肉和肝脏中的恩诺沙星呈一室开放模型，药动学参数如表3所示。动力学方程为C血液=2.528 4×(e-0.044 1t-e-0.310 7t)；C肝脏=2.072 0×(e-0.013 2t-e-0.151 1t)；C肌肉=1.970 2×(e-0.016 5t-e-0.105 8t)。

表3 恩诺沙星在马口鱼各组织中的药动学参数

2.3 恩诺沙星在马口鱼体内的吸收与代谢残留分析

恩诺沙星目前在水产养殖中被广泛使用，因此，本实验中采用连续给药方式，连续5 d给予每尾马口鱼恩诺沙星10 mg·kg-1的剂量，马口鱼血浆中氟苯尼考浓度从1 h的5.089 4 mg·kg-1上升到4 h的峰值11.483 5 mg·kg-1，随后开始下降，从第10 d起，检出含量低于检出限。肝脏中氟苯尼考浓度从1 h的3.277 2 mg·kg-1随后上升，8 h达到峰值10.087 8 mg·kg-1，之后开始下降，但在24 h后再次出现另一个峰，随后持续下降，至720 h检出含量低于检出限。马口鱼肌肉中恩诺沙星浓度从1 h开始缓慢上升至12 h的峰值9.782 1 mg·kg-1，随后开始下降至360 h检出含量低于检出限。

马口鱼属于鲤形目、鲤科，目前该科鱼属的药代研究较少，张雅斌等[8]研究了恩诺沙星在鲤鱼中的血药浓度测定，在25 ℃时，通过单次口灌10 mg·kg-1剂量的恩诺沙星，鲤鱼血药浓度1 h即可到达峰值3.52 mg·kg-1，72 h后的含量约为0.19 mg·kg-1。李改娟等[9]研究了没食子酸对恩诺沙星在福瑞鲤(Cyprinuscarpio)体内的药代动力学及残留的影响，在26 ℃下，单次口服2 mg·kg-1剂量的恩诺沙星，在肝脏和肌肉中的达峰时间和浓度分别为1 h、5.48 mg·kg-1和8 h、1.31 mg·kg-1。李春雨等[10]对两组鲤分别进行腹腔注射，口灌恩诺沙星后，应用高效液相色谱法测定了其组织中的药物浓度，研究了恩诺沙星在鲤(Cyprinuscarpio)体内的吸收、分布与消除等药代动力学参数，结果表明，在19～20 ℃单次口灌5 mg·kg-1剂量的恩诺沙星，肝脏的达峰含量为2.506 5 mg·kg-1，肌肉中的含量为0.380 3 mg·kg-1。

恩诺沙星是水产常见用药，李春雨等[10]的研究结果表明，恩诺沙星在鲤鱼体内血浆、肌肉和肝脏中的消除半衰期分别为168.287 1、57.931和76.137 3 h。而恩诺沙星在牙鲆血液和肝脏中的消除半衰期分别为48.343和10.821 h[11]。恩诺沙星及其代谢物在西伯利亚鲟(Acipenserbaerii)血液、肝脏和肌肉中的消除半衰期分别为32.046、354.987和252.194 h[12]。夏季，俄罗斯鲟(Acipensergueldenstaedtii)血液、肌肉和肝脏中恩诺沙星的半衰期分别为286.166、398.751和201.441 h[13]。本研究中，在(22±2)℃水温下，马口鱼连续5 d口服10 mg·kg-1剂量的恩诺沙星，血液、肝脏和肌肉中的达峰时间分别为4、8和12 h。吸收半衰期分别为2.230 1、4.587 0和6.551 0 h，消除半衰期分别为15.726、52.399和42.081 h。这些数据表明，与另一水产养殖常见用药氟苯尼考相比，恩诺沙星在鱼体内的消除速率较慢，半衰期较长，更加需要注重药物残留问题。

药动学研究中药物的肝肠循环作用(hepato-enteral circulation)是一常见现象，即胆汁排泄后的药物经胆汁排入十二指肠后部分药物可再经小肠上皮细胞被重新吸收，在药动学上表现为药时曲线出现双峰现象，该现象在喹诺酮类药物中的报道较多。本研究中同样发现了恩诺沙星在肝脏内的药时曲线出现双峰现象，表明恩诺沙星在马口鱼体内可能存在肝肠循环作用。

2.4 药效及休药期研究

恩诺沙星药物属于浓度依赖型抗菌药物，对水产养殖中常见的细菌性疾病的治疗效果与PKPD参数有关，如峰浓度(Cmax)/最小抑菌浓度(MIC)。一般认为Cmax/MIC>8时，药物即可起到良好的治疗效果，当Cmax/MIC=10时可发挥最大治疗效果。研究表明，恩诺沙星对嗜水气单胞菌和温和气单胞菌的MIC均为0.048 8 μg·mL-1，对迟缓爱德华氏菌的MIC为3.125 μg·mL-1[14]。

本实验表明，在22 ℃，当用10 mg·kg-1的剂量连续5 d混饲给药后，恩诺沙星在马口鱼血液肝脏和肌肉中的Cmax分别为11.483 5、10.087 8和9.782 1 μg·g-1，所以为能够满足治疗的需要，在鱼类嗜水气单胞菌和温和气单胞菌引起的疾病的急症发作期实际用药时，10 mg·kg-1恩诺沙星的剂量即可满足治疗效果，而治疗迟缓爱德华氏菌引发的疾病时，可以适当加大使用剂量，达到最优的治疗效果。

休药期也叫消除期，指动物从停止给药到许可上市间隔时间的长短，主要影响因素有种属、环境等。我国水产养殖的品种众多，使用的渔药种类及各种药物的制剂类型也较多，极有必要结合水产养殖的制剂水平和用药方式开展休药期研究。根据中华人民共和国农业部公告《动物源性食品中兽药最高残留限量》(农牧发〔2002〕235号)的规定，恩诺沙星在鱼肌肉中的含量不得高于0.1 mg·kg-1，按此标准，本实验的环境为22 ℃，在360 h，即15 d后，马口鱼各组织中的恩诺沙星含量均小于0.1 mg·kg-1，休药期至少为330 ℃·d。

3 小结

应用液相色谱技术测定了连续5 d口服10 mg·kg-1剂量的恩诺沙星后，不同时间点恩诺沙星在马口鱼体内各组织中恩诺沙星的含量，建立药时曲线，并通过3p97药动学软件进行数据处理，探讨恩诺沙星在马口鱼体内的代谢动力学规律。结果表明，在(22±2)℃水温下，血液、肝脏和肌肉中的达峰时间分别为4、8和12 h。吸收半衰期分别为2.230 1、4.587 0和6.551 0 h，消除半衰期分别为15.726、52.399和42.081 h，药时曲线下总面积分别为151.027、328.660和307.200 μg·mL-1·h，为能够满足治疗的需要，在鱼类嗜水气单胞菌和温和气单胞菌引起的疾病的急症发作期实际用药时，10 mg·kg-1的恩诺沙星剂量即可满足治疗效果，而治疗迟缓爱德华氏菌引发的疾病时，可以适当加大使用剂量，达到最优的治疗效果。恩诺沙星在马口鱼体内的建议休药期至少为330 ℃·d。