基于口腔内微生物群落分析牙周炎及阿尔茨海默病的相关性

连健 吴志辉

(1福建卫生职业技术学院医技系，福建 福州 350101；2福建省妇幼保健院检验科)

慢性牙周炎(CP)又称为成人牙周炎，是牙周组织发生的慢性感染性炎症，长期存在的慢性龈炎向牙周膜、牙槽骨和牙骨质深部扩展而引起的，往往会影响口腔咀嚼系统的功能、导致牙齿松动、牙槽骨破坏和牙齿缺失等症状〔1〕。导致慢性牙周炎的始动因子是菌斑微生物，菌斑微生物会造成牙周感染，其中非附着性龈下菌斑和牙周炎的关系更加紧密〔2〕。慢性牙周炎性组织内浸润的T细胞、巨噬细胞等炎性细胞产生释放促炎因子，如白细胞介素(IL)-6、IL-1β等，并可将促炎因子释放到体循环中，由于慢性牙周炎疾病周期很长，血浆炎症因子的水平不断增加，这就致使即使是口腔的低程度感染也可能由于血液中炎症因子的水平增高而引起全身炎性反应〔3〕。阿尔茨海默病(AD)的特点是有明显的炎症特征，可能是由于炎症因子对大脑组织造成了慢性或者进行性的器质性损害，使患者在生活上表现为记忆障碍、抽象思维障碍、空间结构障碍、精神行为障碍及独立生活能力丧失〔4，5〕。AD是在老年时期多见的一种慢性进行性疾病，是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，病情存在不可逆性，使老年人的认知能力和日常生活能力逐渐丧失〔6〕。目前慢性牙周炎和全身系统性疾病的关联性引起了越来越多研究者的兴趣，因此从口腔微生物群落出发探究牙周炎和全身系统性疾病相关性的研究也应运而生。慢性牙周炎可能会对心血管、呼吸、消化、内分泌等系统造成不良影响，并且牙周炎患者与患有类风湿关节炎、肺疾病、慢性进行性肝病和心血管疾病等患者在口腔核心微生物的组成、丰度及代谢途径等方面存在关联性〔7〕。口腔微生物组成以非附着性龈下菌斑中的微生物种类最多，并且AD患者脑组织中检测出的微生物毒力因子的主要来源也是龈下菌斑。所以选用龈下菌斑中的微生物群落作为研究牙周炎和AD相关性的契合点也是符合逻辑的。

1 资料与方法

1.1研究对象 资料信息及菌斑标本均来自2017年6月至2019年8月在福建医科大学附属第一医院进行就诊的患者或体检的健康人群，共90例，平均年龄(69.6±13.5)岁。纳入标准：年龄大于55岁，性别不限，能够完成简易精神状态评价(MMSE)量表评估，配合口腔检查，均签署本次研究的知情同意书。

(1)对照(A)组：30例。受检人群符合牙龈健康、牙周袋深度(PD)≤3 mm、牙周探诊出血率(BOP)率<10%，无临床附着丧失(CAL)，口腔内肉眼不可见明显色素和牙结石，口腔内无种植体，取样牙位及其同牙合同侧邻牙无义齿。(2)牙周炎(B)组：受检人数为30人，符合《牙周病学》中牙周炎的诊断标准确定为中重度牙周炎，口腔内无种植体，取菌斑的牙位无根面龋、无义齿，其合同侧邻牙无义齿〔1〕。(3)AD伴牙周炎(C)组：受检人数为30人，符合2011年AD诊断标准(NIA-AA)确定为AD患者，同时符合《牙周病学》中牙周炎的诊断标准确定为中重度牙周炎〔1〕。

排除标准：受检人患有恶性肿瘤、自身免疫性疾病等严重全身系统性疾病；受检人患有AD之外影响认知的其他疾病；受检人在3个月内进行过牙周病相关治疗及手术，服用过抗菌药物或者非甾体类抗炎药。

1.2实验方法 (1)中重度牙周炎诊断标准：根据第四版《牙周病学》中的诊断标准〔1〕，判定为中重度牙周炎的标准是牙龈有炎症、探诊出血、出现牙周袋、附着丧失，可能会出现牙周溢脓、牙齿松动。牙根分叉区出现病变，牙槽骨吸收加重。(2)精神状态评价：MMSE评分在国际通用，实施方法较为简单，可以有效筛查老年痴呆。由评价者进行提问及记录，包括了定向力(时间定向力和地点定向力)10分，记忆力(即时记忆力和延时记忆力)3分，回忆能力3分，语言能力9分，注意力和计算力5分，满分为30分，回答正确一项计1分。其中分数在27～30分为正常，分数<27即判定为认知功能障碍。分数在21～26分判定为轻度痴呆；分数在10～20分判定为中度痴呆；分数<10分判定为重度痴呆。日常生活活动能力(ADL)量表评分：由躯体生活自理(PSMS)量表和工具性日常生活(IADL)量表两部分组成。PSMS反映生活自理能力，IADL反映使用工具的能力。通过对问题的评价和记录，患者能够做计为1分；做时有一些困难，但是可以完成计为2分；需要帮助才能完成计为3分；根本没法做计为4分。当病人从来没有做过的，但可以胜任的得1分；从来没有做过，但有困难，而不需要别人来帮助，可以得2分；从来没有做，但需要帮助可以得3分；从来没有做，也无法完成时评定为4分。评分范围为20～80分，>23分认为有认知障碍。蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分：评定内容包括语言、命名、注意力、抽象思维、延迟记忆、计算和定向力、视结构/执行功能7个认知领域的11个检查标准，满分30分，≥26分属于认知功能正常，因为此量表受教育程度的影响，因此对教育年限小于12年的患者在总分基础上增加1分，用于校正因文化水平不同造成的偏差。(3)临床信息收集：受检人群的剩余牙数(不计智齿)、探诊出血率、探诊深度、临床附着丧失水平。(4)牙龈下菌斑采集：受检人均在取样前3 h内禁止饮食和刷牙，用无菌水漱口后进行取样。对照组样本取前牙或后牙龈上菌斑，其他两组取样符合要求的牙周探诊深度最深，没有出现溢脓的牙龈下菌斑。取样后立刻封存于2 ml的无菌冻存管并放入冰盒中，在冰浴条件下快速转移至-80℃的冰箱保存。(5)DNA的提取及高通量测序：使用E.Z.N.ASoil DNAKit基因组DNA提取试剂盒(上海索宝生物科技有限公司)，严格按照使用说明提取所有菌斑样本的总DNA。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测样本完整性，荧光仪检测样本DNA的纯度和浓度。设置PCR引物、体系、参数进行PCR扩增，利用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(上海时代生物科技有限公司)对DNA进行鉴定和纯化，构建文库。在苏州金唯智生物科技有限公司进行高通量测序及数据处理，筛选得到高质量的clean data数据，在97%的相似水平下进行操作分类单元(OTU)聚类，进行物种分类注释。(6)Venn图：对得到的操作分类单元进行分析，绘制物种Venn图，统计共有及独有物种数目，获得各组物种组成相似和重叠的情况。(7)细胞因子检测：使用酶标仪(北京普天新桥技术有限公司)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对受检人群血液中的IL-6、IL-1β水平进行检测比较，严格按照试剂盒说明进行操作。

1.3统计学方法 采用SPSS23.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1剩余牙数、牙周临床指标比较 C组剩余牙数明显少于A组与B组(P<0.05)。C组BOP、PD、CAL均明显高于A组和B组，B组明显高于A组(均P<0.05)。见表1。

2.2菌斑中微生物群落分析 通过深度测序后，从每组30例受检人获得共计90个样品，97%的相似度下进行OTU聚类后共产生1 125个操作分类单元，每个操作分类单元都有相应的细菌物种。利用维恩(Venn)图能够简明地观察到各组样品的重叠OTU数量和不同OTU数量。得到3组的组内特有操作分类单元，可以看出3组细菌物种的丰富程度。分别统计A组、B组、C组的操作分类单元数目，共发现738个、643个及925个操作分类单元，其中，A组与B组共享约59.10%的操作分类单元，A组与C组共享约54.99%的操作分类单元，B组与C组共享约55.86%的操作分类单元。A组、B组、C组自身特有的操作分类单元数分别为110、43、248个，显示了C组细菌物种丰富程度最高，其次是A组，最低的是B组。

表1 3组MMSE量表评分、剩余牙数和 牙周临床指标比较

3组核心微生物经过统计后。发现C组中核心微生物最多，有40种，其次是B组，有35种，最低的是A组，有24种。并且经过研究发现，经典的牙周致病菌福赛坦氏菌(Tf)、牙龈卟啉单胞菌(Pg)、中间普氏菌(Pi)、具核梭杆菌(Fn)、齿垢密螺旋体(Td)、直肠弯曲杆菌(Cr)均存在于3组的牙龈下菌斑核心微生物群中。

分析A、B、C组所有的龈下菌斑标本，其中98.56%的微生物由7个菌门组成，互养菌门的平均相对丰度占比为2.13%，放线菌门的平均相对丰度占比为3.56%，螺旋体的平均相对丰度占比为11.61%，梭杆菌门的平均相对丰度占比为12.88%，厚壁菌门的平均相对丰度占比为13.39%，变形杆菌门的平均相对丰度占比为14.37%，拟杆菌门(Bacteroidetes)的平均相对丰度占比为40.62%。对3组龈下菌斑标本的微生物中这7个菌门的平均相对丰度进行对比，见表2。C组互养菌门、螺旋体、梭杆菌门、拟杆菌门相对丰度显著小于B组(P<0.05)，放线菌门、厚壁菌门、变形菌门相对丰度显著大于B组(P<0.05)。C组螺旋体、梭杆菌门、厚壁菌门相对丰度显著大于A组(P<0.05)，放线菌门、变形菌门、拟杆菌门相对丰度显著小于A组(P<0.05)。

表2 3组经典牙周致病菌相对丰度对比

2.3龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌检出率比较 B组牙龈卟啉单胞菌检出率(76.67%)显著高于A组(43.33%)，而C组检出率为100%，显著高于其他两组(P<0.05)。

2.4血清和龈沟液中炎症因子水平比较 无论是血清中还是龈沟液中，B组IL-6、IL-1β水平均明显高于A组，而C组IL-6、IL-1β水平均明显高于其他两组(P<0.05)。见表3。

表3 3组血清和龈沟液中IL-1β、IL-6水平

2.5MMSE、ADL、MoCA评分比较 C组MMSE评分明显低于A组与B组(P<0.05)。C组ADL评分明显高于A组与B组，差异具有统计学意义(P<0.05)。B组的MoCA评分均明显低于A组，而C组的MoCA评分均明显低于其他两组(P<0.05)。见表3。

3 讨 论

目前的许多关于口腔内微生物群的研究都是基于口腔环境健康的人群，通过分析口腔内的菌群组成从而推测与人体其他疾病之间的关联性〔8，9〕。但是事实上，在其他疾病与牙周疾病共同存在时，根据疾病的状态均有相应的核心微生物群，这种核心微生物群的存在保证了菌群的生态环境的稳定〔10～12〕。因此，对不同口腔状态下及口腔疾病伴其他疾病时的核心微生物群进行了解，对疾病的相互影响及疾病的防治都有一定的指导意义。本研究显示同时患有AD和牙周炎患者要比单纯的牙周炎患者有更差的牙周健康状况，并且剩余的牙数也更少；患有牙周疾病后牙周环境中的核心微生物种类会增多，提示可能当牙周炎患者伴有AD时，原本的牙周致病菌的种类变化导致了菌群的比例失调，而菌群的环境状态失调导致了某些牙周致病菌群的代谢更加活跃，以至于牙周情况更差〔13，14〕；牙龈卟啉单胞菌及其毒性产物可能通过血脑屏障进入大脑，这些病原体通过破坏血管的完整性直接或间接对大脑产生影响，导致长期的慢性炎症反应，并最终导致神经退行性疾病〔15，16〕。有报道显示IL-6参与了牙周炎的主要病理过程，并且在AD患者的神经炎斑点中和斑点周围及皮质和海马体中IL-6的含量水平都非常高，大量IL-6的分泌和激活有可能是导致AD发病的重要因素〔17，18〕。本研究结果表明，精神状态量表评分结果差的牙周炎患者比单纯牙周炎的患者在牙周临床指标中表现更差，剩余牙数也更少，预示着牙周炎加重了认知功能的损害。

综上，牙周炎的发生常常在40岁以后，在50岁后达到高峰，而AD多发于55岁后，在70岁后到达高峰〔19，20〕。时间顺序上来说，牙周炎和AD的关系符合时间关联性的逻辑与合理性，所以有理由认为牙周炎可能是影响AD的危险因素之一。