基于AKT信号通路探讨替吉奥对大肠癌细胞株增殖、迁移和侵袭的影响

贺连栋 薛兴翠 王鑫

(青海红十字医院，青海 西宁 810000)

大肠癌包括结肠癌和直肠癌，是人类常见恶性肿瘤之一，在全球男性、女性恶性肿瘤中分别居第3位和第2位，全球每年新发病例约800万人，主要集中于40～50岁人群〔1,2〕。据统计，2017年美国癌症发病例数、死亡例数分别为168.878万、60.092万，其中大肠癌发病例数、死亡例数分别为13.543万、5.026万〔3〕。2015年中国癌症发病例数、死亡例数分别为429.2万、281.4万，其中大肠癌发病例数、死亡例数分别为37.63万、19.10万，发病率、死亡率均高于世界平均水平，且呈上升趋势〔4,5〕。目前临床常规治疗大肠癌手段包括切除原发肿瘤、化疗后放疗和手术后的免疫治疗，但效果并不尽如人意，术后复发、转移患者约占62.4%〔6〕。大肠癌患者的5年生存率不足60%，术后转移是影响生存期的重要因素，是导致大肠癌患者死亡的主要原因〔7,8〕。替吉奥是新型抗癌药物，临床上其治疗胃癌安全有效，可降低胃癌细胞增殖、侵袭能力，促进凋亡〔9〕。蛋白激酶B(AKT)通路是癌细胞侵袭、迁移过程中重要信号转导途径〔10〕。但目前替吉奥对大肠癌的影响尚不明确。本研究将基于AKT信号通路探讨替吉奥对大肠癌细胞株HT-29增殖、迁移和侵袭的影响，为大肠癌临床治疗提供一定理论价值。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 大肠癌细胞株HT-29细胞、胎牛血清、基质胶、蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白试剂盒、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抗体、磷酸化(p)-PI3K抗体、p-AKT抗体、AKT抗体、增殖细胞核抗原(PCNA)抗体、基质金属蛋白酶(MMP)-9抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(货号：SCC-110711、S9030、354234、BC3640、PT0001、bs-0128R-2、bs-5538R-2、bs-5194R-2、bs-0115R-2、K101310P、K002290P、M1000110、SR134)购自上海恒斐生物科技有限公司；替吉奥(国药准字：H20080802)购自山东新时代制药有限公司；RPMI1640培养基、胰蛋白酶、化学发光试剂盒(货号：ZY-3291R、ZY-B4637、ZY-11256)购自上海泽叶生物科技有限公司；青霉素、链霉素(货号：PPSJ-100247、PPSJ-100309)购自厦门慧嘉生物科技有限公司；CCK-8试剂、结晶紫染液(货号：QN1293-OIR、GL0942-PYK)购自北京百奥莱博科技有限公司；Transwell小室(货号：354480)购自上海研卉生物科技有限公司；培养箱(型号：MIR-162-PC/MIR-262-PC)购自日本松下公司；全自动酶标仪(型号：ELX800)购自BIO-TEK公司；显微镜(型号：CX31)购自日本Olympus公司；化学发光成像系统(型号：ChemiDocXRS)购自美国Bio-Rad公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养与分组 将HT-29细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml链霉素、100 U/ml青霉素的RPMI1640培养基中，于37℃、5% CO2培养箱中进行培养，待HT-29细胞进入对数期时，用胰蛋白酶消化，制备成1×105个/ml的单细胞悬液，接种于6孔板中，每孔100 μl。待细胞融合率达到70%～80%时，分为：对照组(HT-29细胞)；20 μg/ml替吉奥组(HT-29细胞+20 μg/ml替吉奥)；50 μg/ml替吉奥组(HT-29细胞+50 μg/ml替吉奥)；100 μg/ml替吉奥组(HT-29细胞+100 μg/ml替吉奥)。

1.2.2CCK-8法检测各组HT-29细胞增殖情况 培养1.2.1中各组HT-29细胞，分别于培养24 h、48 h、72 h后加入CCK-8试剂，继续培养2 h，用全自动酶标仪(450 nm波长)检测各孔吸光度值(OD)。

1.2.3Transwell法检测各组HT-29细胞迁移情况 用无血清培养液制备1×105个/ml HT-29细胞悬液，按1.2.1中分组处理，分别向Transwell小室上层加入200 μl，下室中均加入500 μl含10%胎牛血清的培养液，置于37℃、5% CO2培养箱中孵育24 h，擦去小室膜上未穿膜的细胞，用4%多聚甲醛固定下层迁移细胞，10 min后磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，用0.5%结晶紫染液染色，20 min后PBS洗涤。在倒置显微镜下观察拍照，随机选取200倍镜下的6个视野，统计迁移细胞数。

1.2.4Transwell法检测各组HT-29细胞侵袭情况 用无血清培养基稀释基质胶(1∶8)，并向每个Transwell小室中加入50 μl，37℃放置1 h凝固。后续操作均与1.2.3中检测细胞迁移情况步骤相同，选6个视野统计侵袭细胞数。

1.2.5Western印迹法检测各组HT-29细胞中AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、PCNA、MMP-9蛋白表达情况 培养1.2.1中各组HT-29细胞，48 h后收集细胞，使用蛋白提取试剂盒提取各组细胞总蛋白，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度。将蛋白样品与等量的上样缓冲液混合均匀，100℃变性5 min，依次进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离、转膜、封闭，加一抗(1∶500稀释的AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、PCNA、MMP-9抗体与1∶1 000稀释的GAPDH抗体)4℃孵育过夜，TBST洗涤后加二抗(1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)室温避光孵育1 h，TBST洗膜，使用化学发光显影试剂盒进行显影，Tanon 600图像分析系统扫描灰度值，以GAPDH为内参，分析AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、PCNA、MMP-9表达水平。

1.3统计学分析 采用SPSS24.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1替吉奥对HT-29细胞增殖的影响 随着时间延长，各组HT-29细胞OD450值均显著升高(均P<0.05)。在24 h、48 h、72 h时，20、50、100 μg/ml替吉奥组HT-29细胞OD450值均显著低于对照组(均P<0.05)，且随着替吉奥浓度升高，HT-29细胞OD450值依次降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2替吉奥对HT-29细胞迁移的影响 与对照组相比，20、50、100 μg/ml替吉奥组HT-29细胞迁移细胞数均显著降低(P<0.05)；随着替吉奥浓度升高，HT-29细胞迁移细胞数依次降低，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2、图1。

2.3替吉奥对HT-29细胞侵袭的影响 与对照组相比，20、50、100 μg/ml替吉奥组HT-29细胞侵袭细胞数均显著降低(P<0.05)；随着替吉奥浓度升高，HT-29细胞侵袭细胞数依次降低，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2、图2。

2.4替吉奥对HT-29细胞中AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、PCNA、MMP-9蛋白表达的影响 与对照组相比，20、50、100 μg/ml替吉奥组HT-29细胞中p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、PCNA、MMP-9蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)；随着替吉奥浓度升高，HT-29细胞中p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、PCNA、MMP-9蛋白表达水平依次降低，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2、图3。

表1 各组HT-29细胞OD450值比较

表2 各组HT-29细胞迁移、侵袭细胞数及AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、PCNA、MMP-9蛋白表达比较

图1 各组HT-29细胞迁移情况(结晶紫染色，×200)

图2 各组HT-29细胞侵袭情况(结晶紫染色，×200)

图3 各组HT-29细胞中AKT、p-AKT、 PI3K、p-PI3K、PCNA、MMP-9蛋白表达情况

3 讨 论

大肠癌作为消化系统常见的恶性肿瘤，发病率、死亡率较高，严重威胁人类的生命健康。大肠癌发病隐匿，早期症状不明显，大部分患者确诊时往往已处于晚期，采取手术、化疗治疗的疗效并不显著〔11〕。目前用于治疗大肠癌的化疗药物大多通过竞争性抑制核苷酸合成、细胞毒作用杀死肿瘤细胞，常引起呕吐、骨髓抑制、耐药性等副作用〔12〕。替吉奥是一种新型抗癌药物，属于氟尿嘧啶衍生物，是由活性成分替加氟、奥替拉西钾和吉美嘧啶组成的复合制剂，生物利用度好，作用时间长，能减轻化疗药物氟尿嘧啶的不良反应〔13〕。张杭等〔14〕研究表明，替吉奥联合多西他赛治疗局部晚期胃癌，能显著降低血清中肿瘤转移侵袭相关指标表达水平，提高近期疗效、预后生活质量，并减低毒副反应。郁昊等〔15〕研究表明，替吉奧辅助多西他赛、奥沙利铂对晚期胃癌进行化疗治疗，可显著降低患者血清肿瘤标志物水平，并抑制血管新生因子及细胞侵袭分子释放。黄丹等〔16〕研究表明，替吉奥联合草酸铂可能通过调控ATK信号通路抑制胃癌细胞侵袭。本研究结果提示替吉奥可以抑制大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，且其浓度越高，抑制作用越强，但具体调控机制尚不明确。

大肠癌的发生发展涉及多种信号通路的多阶段、多步骤过程。PI3K/AKT信号通路是重要的细胞内信号通路，调节细胞增殖、细胞凋亡、细胞转化等各种细胞功能，与癌症发生发展亦密切相关〔17〕。研究表明，AKT信号通路在许多肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭过程中均发挥重要作用，AKT是PI3K下游调控肿瘤发生发展的核心靶基因，PI3K激活后使其发生磷酸化，将信号传递至下游底物，调节凋亡、转录及翻译等生物学效应〔18〕。PCNA参与DNA甲基化、DNA修复、染色质重塑等多种细胞代谢途径，是一个非致癌的抗癌靶点〔19〕。刘皓葳等〔20〕研究发现，下调PCNA蛋白表达可能抑制大肠癌细胞增殖。MMP-9是一种蛋白水解酶，在肿瘤细胞转移、侵袭、新生血管形成、降解基底膜等过程中发挥重要作用，是恶性肿瘤细胞转移、侵袭的潜在标志〔21〕。覃辉等〔9〕研究表明，替吉奥在抑制胃癌细胞侵袭、促进胃癌细胞凋亡过程中能显著下调MMP-9蛋白表达。本研究结果提示替吉奥可能通过抑制PI3K/AKT信号通路相关蛋白AKT、PI3K磷酸化，进而下调PCNA、MMP-9蛋白表达，发挥抑制大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。

综上所述，替吉奥可能通过抑制AKT信号通路激活，发挥抑制大肠癌细胞HT-29增殖、迁移和侵袭的作用。但替吉奥对其他大肠癌细胞系的作用是否也是如此尚不明确，另对大肠癌细胞凋亡、细胞周期、促血管生成的影响亦不清楚，还需进一步研究。